重組豬IFNα的構建及原核可溶性表達研究

蔡家利，戶國達，孫加燕，尹忠寶，張存亮，陳文毫

病毒性傳染病是困擾我國養豬業發展最突出的問題之一，每年因病毒感染引起豬死亡和生長障礙而造成的經濟損失無法估計。干擾素(interferon，IFN)是一種可抑制病毒復制的細胞因子，是由病毒或其他IFN誘導劑作用于易感細胞后產生的一種小分子糖類蛋白，具有廣譜的抗病毒、抗腫瘤及免疫調節等功能［1］。據報道在各種類型的IFN 中，IFN-α 的抗病毒作用最強［2，3］。

目前，市售的豬α-干擾素由豬白細胞和原核表達系統獲得，僅豬白細胞IFN獲得農業部新獸藥的批文［4］。白細胞干擾素來源極其有限，大大制約了其應用。原核表達系統，尤其是大腸桿菌表達雖然表達效率高，但表達出的重組豬α-干擾素多是以不溶的無功能的包涵體形式存在，必須通過復雜的變性復性過程才能獲得有功能的蛋白，并且成功率較低。近年來，很多專家學者將研究重心轉移到酵母菌［5］、桿狀病毒、腺病毒［6］、轉基因植物［7］上，并取得了重大成果，但是始終存在一些技術瓶頸，如豬α-干擾素的表達水平偏低、高密度發酵工藝復雜等，還無法實現豬IFN-α的規模化生產。據報道，豬IFN-α無需翻譯后加工修飾，采用新的可溶表達策略即可實現其在大腸桿菌表達系統中的可溶性表達，大大加快了豬α-干擾素規模化生產進程。

本研究采用新的可溶性策略，構建了原核表達載體pET32a-poIFNα，通過與Trx融合表達，實現了豬α-干擾素的可溶性表達，只需一步純化，即可獲得純度較高的豬α-干擾素重組產物。這對豬α-干擾素作為新的生物藥物的進一步開發利用具有極其重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 載體與菌株

pET32a+、大腸桿菌 DH5α和 BL21菌株，由重慶富進生物醫藥有限公司饋贈。

1.1.2 工具酶及其他材料

DNA抽提試劑盒、蛋白Marker購自天根公司;TaqDNA聚合酶、DNA Marker、限制性內切酶EcoR I和Xho I、T4連接酶、質粒提取試劑盒、膠回收試劑盒均購自TaKaRa公司;Ni-NTA親和樹脂來源于分子生物學實驗室;其他試劑均為國產分析純產品。

1.1.3 抗體

抗豬α-干擾素鼠源單抗;羊抗鼠IgG-HRP。

1.2 PCR擴增IFN-α

提取新鮮豬肝臟組織基因組DNA，根據Gen-Bank中豬IFN-α基因序列(登錄號為M28623.1)設計引物。上游引物為5’-GGAATTCTGTGACCTGCCTCAG-3’;下游引物 5’-CCGCTCGAGTCACTCCTTCTTCCTGAGT-3’。在上、下游引物中分別引入 EcoR I、Xho I酶切位點(下劃線表示)。PCR反應體系按照TaqDNA聚合酶附帶的說明書制定。反應條件為:95℃預變性5 min，然后經歷94℃ 45 s、61℃ 45 s、72℃ 1 min 共35 個循環，72℃延伸7 min。PCR產物鑒定后回收純化，-20℃保存。

1.3 重組質粒pET32a-IFN-α的構建

分別回收EcoR I、Xho I酶雙酶切后的PCR產物和pET32a質粒，按體積比7∶1，16℃連接過夜。將連接反應產物轉化新鮮制備的DH5α感受細胞，使用含終濃度為100 μg/mL Amp的LB進行篩選。過夜培養后，進行菌落PCR鑒定，對陽性克隆提取質粒進行雙酶切鑒定，然后送TaKaRa公司測序，并對結果進行分析。

1.4 工程菌的構建

將測序為陽性的重組質粒轉化表達菌株BL21(DE3)，用含Amp的LB平板進行篩選。過夜培養后，進行菌落PCR鑒定，對陽性克隆提取質粒進行雙酶切鑒定。

1.5 rpoIFN-α的誘導表達

挑選篩選出的陽性BL21(DE3)單克隆菌株，接種于5mL含終濃度為100 μg/mL Amp的LB液體培養基，37℃過夜培養。將菌液按體積比1∶100接種到20 mL含 Amp的培養基中，37℃培養至OD600為0.6～0.8時加入終濃度為0.5 mmol/L的IPTG，22℃培養8 h后收集菌液，5 000 r/min離心取沉淀。按照每1 g菌加入10 mL PBS的比例，使其重懸，然后超聲破菌。破菌液離心后，分別取上清和沉淀進行SDS-PAGE分析［8］。

1.6 rpoIFN-α的純化

22℃誘導表達3L菌液，離心收集菌體。按體積比1∶3～1∶10的比例加入裂解液，超聲破碎后離心收集破菌上清。用0.45 μm的水系過濾器過濾一次，隨流動相進入已平衡好的Ni柱。用平衡Buffer平衡柱子，收集穿透液，再用 20、50、100、200、400 mmol/L咪唑梯度洗脫，每次洗脫體積為40 mL，用SDS-PAGE分析純化效果。

1.7 Western-blot鑒定

取純化后的表達產物10 μL，進行SDS-PAGE電泳。在100 V條件下電轉2 h，將rpoIFN-α從SDS-PAGE膠上轉移到NC膜上。用5%的脫脂奶粉(用PBST配置)37℃封閉2 h，再用PBST洗膜3次。加入抗豬α-干擾素鼠源單抗(1∶2000稀釋)，37℃孵育1 h，再用PBST洗膜3次。加入羊抗鼠IgG-HRP(1∶4000稀釋)，37℃孵育1 h。再用PBST洗膜3次。加入DAB顯色液暗區反應5～10 min，用水進行漂洗。

2 結果

2.1 重組質粒pET32a-IFN-α的鑒定

2.1.1 PCR鑒定

菌落PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在501bp附近位置有明顯的條帶(見圖1)，與預期相符。

圖1 重組pET32a+-PoIFNα質粒菌落PCR鑒定結果

2.1.2 雙酶切鑒定

重組質粒pET32a+-PoIFNα經限制性內切酶EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切后可見線性質粒的條帶及501bp的目的基因片段，與PoIFNα基因的大小相吻合(見圖2)。

圖2 重組pET32a+-PoIFNα質粒雙酶切鑒定結果

2.1.3 測序結果與分析

經比對，克隆得到的基因序列與Genebank上登錄號為AY776246、M28623的poIFNα同源性分別為99%、97%(見圖3)，初步認定克隆得到的基因是PoIFNα基因，可以用來制備PoIFNα。

圖3 DNA序列比對

2.2 PoIFNα的表達

經過對誘導劑濃度、誘導溫度和誘導時間的研究，確定出可溶性表達最佳誘導條件為22℃，10 h，0.5 mmol/L IPTG。用最佳條件誘導后，破菌上清與沉淀經SDS-PAGE分析，poIFNα多以可溶性表達的形式出現在破菌上清中(見圖4)。

圖4 重組蛋白可溶性分析

2.3 PoIFNα的純化結果

梯度洗脫，收集到的蛋白經SDS-PAGE分析后，濃度為20 mmol/L時可以洗去幾乎所有的雜蛋白，在50 mmol/L時進一步純化，在100 mmol/L時洗脫即可得到純度很高的PoIFNα，為大量產物純化奠定了基礎(見圖5)。

圖5 PoIFNα純化電泳圖

純化后的PoIFNα經Western blot檢測在膜上有特異性的條帶出現(見圖6)，進一步證實產物為PoIFNα。

圖6 Western blot結果

3 討論

大腸桿菌表達真核蛋白時，多形成不溶性的、無功能的包涵體。因此，如何實現真核蛋白在大腸桿菌表達系統中的可溶性表達是擺在我們面前亟待解決的問題。

在眾多學者的不斷探索創新中，人們已經積累了一些實現蛋白可溶性表達的經驗:①選擇合適的宿主菌［9］，例如選擇蛋白酶缺失的菌株;②共表達一種或多種分子伴侶或折疊酶［10-11］;③ 選擇適宜的載體，實現融合表達［12］;④ 通過定點突變，改變蛋白結構［13］;⑤ 優化培養條件和誘導條件［14-15］。由于蛋白種類繁多，理化性質各異，目前很難找到一種通用的方法。對于某一蛋白可溶性表達策略的選取，只能在研究中摸索、積累經驗，并同時關注相關領域的研究進展。

本實驗嘗試使用前人在豬α-干擾素原核表達中未曾使用的質粒pET32a+，實現了PoIFNα的可溶性表達，并取得了成功。pET32a+含有TrxA基因，可以與下游多克隆位點插入的目的基因融合表達，所編碼的硫氧還原蛋白可大大提高目的蛋白的溶解度和活性，并且載體上帶有His標簽，通過鎳柱親和層析一步純化即可得到融合蛋白。這為實現其他真核蛋白在大腸桿菌中可溶性表達提供了重要參考。

下一步工作的重心是PoIFNα活性的測定。將采用細胞病變抑制法測定PoIFNα在動物細胞上對動物病毒的抑制作用。

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