薇甘菊萎蔫病毒感染對薇甘菊光合特性和4種酶活性的影響

王瑞龍，潘婉文，楊嬌瑜，張暉，夏晴晴，蘇貽娟，曾任森，*

(1.華南農業大學亞熱帶農業生物資源保護與利用國家重點實驗室，廣州 510642;2.農業部華南熱帶農業環境重點實驗室，廣州 510642;3廣東省普通高等學校農業生態與農村環境重點實驗室，廣州 510642)

研究表明，植物體感染病毒后常出現花葉、矮化、葉片皺縮、頂枯等癥狀，從而使植物的營養生長受到抑制，嚴重時可引起植物局部或系統壞死［1-4］。寄主植物感染病毒后體內會發生復雜的生理生化變化，如光合速率下降，葉綠素降解，葉綠體受到破壞，光化學活性下降等［3-6］。病毒侵染可引起與植物抗病反應有關的一些酶類如超氧化物岐化酶(Superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(Peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase，PAL)和多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)等活性的變化［7-10］。

薇甘菊(Mikania micrantha H.B.K.)是菊科(Compositae)假澤蘭屬(Mikania)多年生草質藤本，屬世界性雜草，原產地為中南美洲［11］，是我國危害性極強的外來入侵植物，目前已經入侵到廣東、廣西、海南、云南、香港、臺灣、澳門等地［11-13］。因其生長速度快，種子量巨大且極易擴散，可以覆蓋其他植物引起森林生態系統退化，對當地的生態環境造成巨大的破壞［12-14］，控制薇甘菊在我國的蔓延已經刻不容緩。

作者發現一種可致使薇甘菊葉片出現萎蔫、葉畸形、皺縮等癥狀的新病毒，將其命名為薇甘菊萎蔫病毒(Mikania micrantha wilt virus，MMWV)，該病毒屬于豇豆花葉病毒科(Comoviridae)蠶豆病毒屬(Fabavirus)龍膽花葉病毒(Gentian mosaic virus，GeMV)的一種新的分離株［15-16］。實驗室內和野外試驗表明，MMWV雖不能使薇甘菊致死，但可有效地抑制薇甘菊的生長，MMWV有可能成為生物防治薇甘菊入侵的方法之一［15-16］。

本文從生理生化角度研究了MMWV侵染對薇甘菊光合特性及與植物抗病反應相關的4種主要酶活性的影響，旨在探明MMWV侵染對薇甘菊生理生化指標的影響，為利用MMWV生物防治薇甘菊提供理論參考依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

MMWV分離自田間發病的薇甘菊，利用分子生物學方法鑒定屬于MMWV［15-16］。

薇甘菊莖段采自華南農業大學試驗農場，剪成長度約9 cm的莖段，扦插在直徑為16 cm的花盆中，每盆1株。待成活后選長勢良好、大小一致的薇甘菊40株。

1.2 試驗方法

1.2.1 接種處理

在薇甘菊幼苗長到有5—6片葉時，采用常規汁液摩擦方法接種MMWV，以接種磷酸緩沖液為對照，分別在接種處理后第8、16、24、32天采集接種葉片并測定各項指標。

1.2.2 SOD 活性的測定

SOD的測定參照王愛國［17］的方法。稱取薇甘菊葉片0.25 g，液氮研磨后加入2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液，渦旋10 s，12000 r/min離心15 min，取上清液為酶液，4℃保存備用。將0.05 mol/L磷酸緩沖液1.5 mL，130 mmol/L 甲硫氨酸溶液 0.3 mL，750 μmol/L 氮藍四唑 0.3 mL，100 μmol/L EDTA-Na20.3 mL，20 μmol/L核黃素0.3 mL，酶液50 μL，蒸餾水0.25 mL加入到比色杯中。混勻后將一管置于黑暗處，其余各管置于4000 lx日光燈下反應20 min。反應結束后，以黑暗處的為空白對照，分別測定吸光度值，重復4次。

1.2.3 PAL 活性的測定

PAL的測定用分光光度法［18］。稱取薇甘菊葉片0.1 g，液氮研磨后轉移至2 mL的離心管中，加入1 mL PAL酶提取液，振蕩1 min，4℃ 12 000 r/min離心15 min，取上清液為酶源，4℃保存備用。在試管中各加入0.02 mol/L L-苯丙氨酸1 mL，0.05 mol/L Tris-H2SO4緩沖液 2 mL，0.5 mL 酶液，對照只加入0.5 mL PAL 酶提取液。40℃水浴30 min，在290 nm處測吸光度值，以OD290 nm值變化0.01為一酶活力單位，重復4次。

1.2.4 POD 活性的測定

POD采用愈創木酚法測定，參照袁慶華等［10］的方法。稱薇甘菊葉片0.25 g，液氮研磨后轉入離心管，加2.5 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2，內含5% 聚乙烯基吡咯烷酮)，振蕩10 s，12 000 r/min離心15 min，取上清液，4℃保存備用。在比色杯中依次加入1 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.2)，1 mL 0.1 mol/L愈創木酚，1 mL 0.8%H2O2，50 μL酶液后迅速用封口膜封口搖勻，在470 nm處測吸光度值，記錄0—120 s的OD470值，每10 s記錄1次，重復4次。

1.2.5 PPO 活性的測定

PPO測定參照朱廣廉［19］的方法，略有改進。稱取薇甘菊葉片0.25 g，液氮研磨后轉入離心管，加入少量預冷的0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.8，內含5% 聚乙烯基吡咯烷酮)，振蕩10 s，12 000 r/min離心15 min，取上清液，4℃保存備用。在試管中加入3.9 mL 0.05 mol/L磷酸緩沖液(pH值7.8);1 mL 0.05 mol/L兒茶酚溶液;0.1 mL酶液。37℃ 15 min，迅速轉入冰浴并加入2 mL 20%三氯乙酸溶液終止反應，在525 nm處測吸光度值，重復4次。

1.2.6 葉綠素含量的測定

參照舒展等［20］的方法，稱0.1 g薇甘菊葉片放入研缽中，加少量石英砂研磨成糊狀，用80%的丙酮水溶液分批提取葉綠素，直至殘渣無色為止。將丙酮提取液過濾后定容，分別在663、645和440 nm處測吸光度值。根據下列各式計算出葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量，葉綠素a/b的比值［21］，重復4次。

1.2.7 光合作用參數測定

用LI-6400便攜式光合儀(LI-COR，Nebraska，USA)測定MMWV侵染32d后及健康對照薇甘菊葉片在8:00—11:30的光響應曲線，測定時光強梯度由強到弱，依次設定光量子通量密度(photon flux density，PFD)為1500、1000、800、600、400、200、100、80、40、20和0 mmol·m－2·s－1，葉室溫度設置為25℃，測定時將參比室的CO2濃度穩定在 380 μmol·mol－1，在每個光梯度下平衡 180 s后測定凈光合速率(net photosynthetic rate，Pn)［22］。每株測定頂端第5片葉子，重復5次。依據Bassman和Zwier［23］的方法擬合Pn-PFD曲線，計算最大凈光合速率(Maximal net photosynthetic rate，Pmax)、表觀量子效率(Apparent quantum yield，AQY)、暗呼吸速率(Dark respiration rate，Rd)、光飽和點(Light saturation point，LSP)和光補償點(Light compensation point，LCP)。模型的參數通過SPSS 16.0(SPSS Inc.，Chicago，IL，USA)的非線性評價模型進行計算。

1.3 數據處理

運用SPSS 16.0對實驗數據進行分析，用獨立樣本t檢驗分析MMWV侵染對薇甘菊葉片光合特性的影響，所有數據均為平均值±標準誤。

2 結果與分析

2.1 MMWV侵染對SOD、POD、PPO和PAL活性的影響

從圖1可以看出，健康對照薇甘菊葉片內SOD活性保持相對穩定，接種MMWV后，薇甘菊葉片中SOD活性在接種后8—16d分別比對照提高了19.20%和14.19%。而接種MMWV 24—32d后，薇甘菊葉片內SOD活性逐漸減低，其中第32天達到最低值，比對照減低了25.37%。接種MMWV后引起薇甘菊葉片內POD活性發生明顯變化。接種8d后，POD活性比對照逐漸升高，第24天達到最大值，比對照增加了41.12%，24d后POD活性有下降的趨勢，但仍顯著高于對照組。薇甘菊接種MMWV 8d后，葉片內PPO活性達到最大值，比對照顯著增加了77.75%。接種后16—32d PPO活性總的變化趨勢與健康對照組基本一致。接種MMWV 8d后，薇甘菊葉片中PAL活性比對照顯著增加了23.58%。隨后接種薇甘菊葉片內PAL活性開始降低，之后PAL活性又升高，第24天再達峰值，即PAL活性曲線有2個酶峰。第32天感病葉片內PAL活性比對照顯著減低了20.53%。

2.2 MMWV侵染對薇甘菊葉片葉綠素含量的影響

健康對照薇甘菊葉片中的葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量、葉綠素a/b保持相對穩定。受MMWV侵染的薇甘菊葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量自接種后第8天開始緩慢下降，至32d后下降幅度最大。MMWV侵染薇甘菊32d后，薇甘菊葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量、葉綠素a/b分別比對照組減少了 30.76%，18.76%，26.41%和 17.84%(圖 2)。

2.3 MMWV侵染對薇甘菊葉片光合特性的影響

MMWV侵染對薇甘菊葉片的Rd，LCP和AQY無顯著影響，其中MMWV侵染使葉片的LCP比對照增加17.53%。MMWV侵染薇甘菊使其葉片的Pmax和LSP分別比對照顯著減少32.34%和12.52%，表明MMWV侵染可影響薇甘菊葉片的光合效率(表1)。

表1 MMWV侵染對薇甘菊葉片光合參數的影響Table 1 Photosynthetic parameters in the leaves of Mikania micrantha after infection by MMWV

圖1 MMWV侵染對薇甘菊葉片中SOD、POD、PPO、PAL活性的影響Fig.1 Changes of SOD，POD，PPO and PAL activities in the leaves of M.micrantha after infection by MMWV

3 討論

研究表明病毒侵染可引起寄主植物體內SOD，POD，PPO等與植物抗病性相關的酶活性變化［7-8，10，24-26］。野生大豆(Glycine max)的PPO和PAL活性與對大豆花葉病毒(Soybean mosaic virus，SMV)的抗性呈顯著正相關，可利用葉片中PPO和PAL活性水平作為野生大豆病毒病抗性鑒定的參考指標［8］。研究發現煙草接種黃瓜花葉病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)的PE、M和Xb等3種毒株后，Xb和M毒株可引起SOD活性前期升高、后期活性下降;M毒株導致PAL活性一直保持在較高水平，而PE毒株則導致PAL活性下降。PE和M毒株均導致POD酶活性升高［7］。本實驗結果顯示MMWV侵染薇甘菊前期可誘導SOD、POD、PPO和PAL活性提高，尤其是PPO活性比健康對照增加了77.75%。隨著侵染時間的增加，感病薇甘菊葉片中SOD、PPO和PAL的活性逐漸降低，而POD的活性則保持相對較高的水平(圖1)。同理黃瓜(Cucumis sativus)苗期感染黃瓜枯萎病(Fusarium axysporum f.sp.cucumerinum Owen)后，葉片組織中POD，SOD，PPO活性變化曲線存在2個酶峰，PAL活性變化曲線存在1個單峰;其中抗病品系的POD和PAL活性的提高與抗性呈顯著正相關，而SOD和PPO活性的提高與抗性呈極顯著正相關［9］。

病毒侵染寄主植物后，在細胞內大量地復制、增殖可破壞寄主細胞葉綠體結構和功能使葉綠素含量下降［23，27］，導致寄主植物的光合作用效率降低甚至死亡［1，5-16，28］。番茄黃化曲葉病毒(Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV)侵染可導致番茄(Lycopersicon esculentum)葉片中葉綠素a、葉綠素b、葉綠素總含量、凈光合速率和氣孔導度分別比健康植株下降50.2%、24.19%、43.84%、43.28%和27.07%［2］。馬鈴薯 Y 病毒(Potato virus Y，PVY)侵染馬鈴薯(Solanum tuberosum)60d后，侵染葉片中的凈光合速率、葉綠素含量和電子傳遞速率分別減少了49.4%、40.2%和 72.9%［4］。蕪菁花葉病毒(Turnip mosaic virus，TuMV)侵染青菜(Brassica chinensis)和芥菜(Brassica juncea)后導致寄主葉片的葉綠素含量、光合速率、蒸騰速率明顯降低［3］。蠶豆萎蔫病毒2(Broad bean wilt virus 2，BBWV 2)B935和PV131侵染蠶豆(Vicica faba)使感病蠶豆葉片中葉綠素含量減少，葉綠素a/b值逐漸降低［29］。本研究結果顯示MMWV侵染薇甘菊32d后使葉片中葉綠素a、葉綠素b和葉綠素總含量顯著減低(圖2)，同時葉片中Pmax和AQY分別比對照顯著降低了32.34%和12.52%(表1)。表明MMWV侵染可影響薇甘菊葉片中葉綠體的結構和功能，從而導致葉片光合效率降低。病毒侵染導致寄主的葉綠素含量降低是由于葉綠體結構發生破壞所致［27］，碳同化酶活性下降，可能是造成光合作用速率降低的主要原因［4，30-31］。

圖2 MMWV侵染薇甘菊后不同時間階段葉片中葉綠素含量Fig.2 Chlorophyll contents in the leaves of Mikania micrantha at different stages after infection by MMWV

目前防治薇甘菊的措施主要有4種即人工清除、化學防除、生物防治和生態控制［11］。人工清除適用于薇甘菊危害面積較小的區域，大面積人工清除費時費力且易復發。化學防除易造成環境污染，薇甘菊可能在數年后再次為害。生物防治是利用薇甘菊的病原微生物和天敵昆蟲(真菌、細菌、病毒、螨類等)進行控制。Ellison等［32］發現薇甘菊柄銹菌Puccinia spegazzinii僅侵染薇甘菊屬植物。安婀珍蝶(Actinote anteas)［33］、紫紅短須螨(Brevipalpus phoenicis)［34］和小蓑蛾(Acanthophyche sp)［35］等可取食薇甘菊的莖葉。田野菟絲子(Cuscuta campestris)可控制薇甘菊生長，但不能根除薇甘菊［11］。生態控制目前主要是利用幌傘楓(Heteropanax fragrans)［11］和芒萁(Dicranopteris pedata)［36］等本地物種控制薇甘菊的生長。發現和利用天敵控制外來入侵生物作為新興的方法值得做深入的研究［15-16］。研究發現MMWV侵染薇甘菊30d后，其莖的長度、根、莖和葉的鮮重分別比健康對照植株減少了75.3%、75.6%、79.5% 和91.6%，MMWV可抑制薇甘菊的生長［16］。當前，薇甘菊的防治仍是世界性難題，研究所發現的天敵雖可使薇甘菊致病甚至死亡，但在實際應用中控制薇甘菊的擴散尚未見報道［11，15，37］。

本研究表明MMWV通過降低薇甘菊葉片的光合特性和與抗病性相關的酶活性，從而抑制薇甘菊的生長。雖然該病毒有望被用來進行薇甘菊的生物控制，有關生態風險評價尚需深入研究。

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