舟山群島四個養殖獐種群遺傳多樣性和遺傳結構

林杰君，鮑毅新，劉 軍，王艷妮，張 旭

(浙江師范大學生態研究所，金華 321004)

獐(Hydropotes inermis)，別名牙獐、河麂，屬于偶蹄目(Artiodactyla)鹿科(Cervidae)獐屬(Hydropotes)，是國家Ⅱ級重點保護動物，目前在我國較集中的分布區是浙江舟山群島、江蘇沿海地區、江西鄱陽湖地區、湖南、湖北的洞庭湖和廣大水網地區［1］，而以舟山群島上的分布數量最多［2-3］。由于經濟利益的驅使，使得獐的偷獵現象非常嚴重，根據2009年對舟山市鹿科動物資源的調查，舟山群島野生獐的資源總量約為2100—2600只，比1997年已銳減一半。人為養殖種群被認為是一種保護瀕危物種的重要手段［4］，能有效減少偷獵行為的發生。近年來，隨著對獐的日益了解和養殖技術的不斷發展，養殖獐已成為熱點并得到了迅速發展，其種源主要來自舟山群島［5］。目前，在舟山群島養殖獐種群數量約1000余只，主要集中在舟山本島、秀山島、岱山島和朱家尖島，其它島嶼基本上沒有獐養殖場。為了保持獐資源的可持續利用，有必要對養殖獐種群的遺傳多樣性和遺傳結構進行分析。

迄今為止，獐的研究主要集中在行為觀察［6-7］、生境選擇［8-9］及致危原因［10-11］等方面。在分子生物學方面的研究，Hu等［12-13］曾應用微衛星標記和線粒體控制區對大陸種源和舟山種源的獐種群進行分析，兩者的結果都發現舟山種源的獐種群遺傳多樣性水平要低于大陸種群。舟山群島是在第三紀末浙東地層下降時，與大陸分離而形成的，屬于里亞斯型海島區地貌，各島嶼間被海水隔離，在一定程度上阻礙了獐在不同島嶼間的遷移，這可能是造成舟山種群遺傳多樣性偏低的主要原因。

簡單重復序列間區(ISSR)標記技術是在微衛星標記的基礎上直接建立起來的一種分子標記技術［14］，具有簡單、經濟、快速、有效等優點。近年來，也越來越多地被應用到動物研究中來，并在動物遺傳多樣性及遺傳結構方面取得了不錯的研究成果［15-17］。本研究利用ISSR分子標記對舟山不同島嶼上養殖場內獐種群的遺傳多樣性和遺傳結構進行分析，并深入探討了各養殖場獐種群的遺傳特點，以期為舟山群島獐保護策略的制定和實施提供科學的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料采集

在獐養殖場比較集中的舟山本島、秀山島、岱山島和朱家尖島，選擇規模較大、養殖規范、有代表性的4個獐養殖場進行采樣，各種群采樣地見圖1，各采樣養殖場所在島嶼的生態特征和采樣數量見表1，根據個體來源的記錄，實驗所用樣本是捕獲于各養殖場所在的島嶼或由這些個體相互交配所產的后代，以自然死亡個體和由于年老等原因而淘汰個體的少量肌肉組織作為實驗樣本，由各養殖場提供，在選擇樣本過程中，一般是根據養殖場的個體來源記錄，選擇無血緣關系或親緣關系較遠的個體，避免個體間存在直系血緣關系，帶回實驗室置于-70℃冰箱中保存備用。

圖1 4個獐種群取樣地點Fig.1 Location of the four cultured populations of Hydropotes inermis in Zhoushan Archipelago

表1 四個取樣島嶼的生態特征及樣本量Table 1 Ecological characteristics of the four islands and number of samples

1.2 DNA提取

參照鮑毅新等［18］改進的方法對肌肉組織進行基因組DNA的提取。

1.3 引物選擇及PCR擴增

本實驗共使用26條ISSR引物，包括已發表的可應用于獐物種的10條(UBC 808、809、811、816、818、827、830、841、844、848)［19］，另外，篩選出多態性高、標記位點豐富、重復性好的適合獐基因擴增的ISSR引物16條(UBC 807、810、812、815、822、823、826、834、836、840、842、855、857、858、860、873)，各引物的序列和最佳最火溫度見表2。

ISSR-PCR反應體系及擴增程序采用張龍龍等［19］所確立的獐ISSR-PCR反應最優體系及擴增程序，其中對最佳循環次數進行優化，發現35次循環時，效果最好，其余步驟均相同。擴增產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳分離(120 V，90 min)，使用BIO-RAD紫外凝膠成像系統(購自BIO-RAD公司)拍照、觀察。

1.4 數據分析

用軟件Gel-Pro 4.5統計條帶的數目及長度，然后檢測不同種群個體條帶的有無，清晰可見的條帶全部用于統計分析。按條帶的有無進行計數，在指定遷移位置出現的條帶，被認為是具有相同的DNA片段產物，計數為“1”，不存在則為“0”，構建“01”二元矩陣數據，以此把圖像數據轉化為二元數據。

采用POPGENE 1.32軟件［20］計算4個種群的觀察等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、Nei′s遺傳多樣性指數(H)、Shannon′s多態信息指數(I)和多態位點百分比(PPL)等遺傳多樣性指標，并計算物種水平上的各遺傳多樣性指標，以及各種群間的遺傳分化系數(Gst)、Nei′s遺傳距離(GD)和遺傳相似度(GI)。

利用Arlequin 3.11軟件［21］對各種群進行遺傳結構的分子變異分析(AMOVA)。

利用Structure 2.2軟件［22，23］對4個獐種群進行貝葉斯聚類分析，對參數MCMC開始時的不作數迭代和不作數迭代后的MCMC(number of MCMC reps after burn-in)都設置為10000次，K值為1—6，每個K值各自獨立運行5次，計算每個K值下的對數似然函數值(lnP(D)，log likelihood function value)，并取平均值即為每個K的lnP(D)，再利用公式:，計算出每個K值相對應的△K值，其中L( K)=lnP( D)［24］。根據K與△K的關系，確定最佳K值，即為從遺傳結構上認定的最佳組群數。

2 結果與分析

2.1 26條ISSR引物擴增結果

從表2中可以看出，26條ISSR引物共擴增出286個位點，平均每條引物擴增出11條DNA片段，引物UBC 810擴增出的位點數是最多的，共有17個位點，而引物UBC 816擴增出的位點數是最少的，只有7個位點，其余引物擴增出的位點數介于兩者之間。共擴增出184個多態性位點，即平均每條引物擴增出7個多態性位點，總的多態性比率為64.34%。其中，引物UBC 812揭示的變異是最高的，多態性比率高達90.91%，而引物UBC 860的多態性比率只有37.50%，其所反映的變異是最低的，其余ISSR引物的多態性比率介于兩者之間，圖2和圖3為部分引物在一些獐個體中的擴增電泳圖，結果顯示，擴增效果較為清晰。以上結果表明本次實驗所選用的這26條ISSR引物可用于獐遺傳多樣性和遺傳結構的分析。

圖2 ISSR引物UBC 822在部分個體中的擴增電泳圖Fig.2 The amplification of primer UBC 822 in several individuals of Hydropotes inermis

2.2 獐種群的遺傳多樣性差異

從表3的觀察等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、多態位點百分比(PPL)、Nei′s遺傳多樣性指數(H)和Shannon′s多態信息指數(I)這些遺傳多樣性參數來看，不同獐種群的遺傳多樣性存在一定差異，各項遺傳參數均以舟山本島獐種群(ZS)最高(Na=1.486，Ne=1.333，H=0.190，I=0.278，PPL=48.60%)，其次為岱山種群(DS)、秀山種群(XS)、朱家尖種群(ZJJ)，且其物種水平上的遺傳多樣性要高于種群水平，種群水平表示的是各種群間的平均水平，而物種水平是將所有個體當作一個大種群來研究，顯示的是舟山群島獐的整體水平，所以其值較高。

表2 26條引物名稱、序列、最佳退火溫度及其在四個種群中的擴增條帶數與多態性比率Table 2 Names，sequences，annealing temperatures and polymorphic ratios of the loci amplified by 26 ISSR primers

圖3 ISSR引物UBC 841在部分個體中的擴增電泳圖Fig.3 The amplification of primer UBC 841 in several individuals of Hydropotes inermis

表3 舟山4個獐種群遺傳多樣性差異Table 3 Genetic diversity of four Hydropotes inermis populations in Zhoushan Archipelago

2.3 獐種群遺傳結構分析

通過計算△K發現，當K=4時，△K取得最大值，由此認為，所有個體根據遺傳結構組成不同可分為4個組群。當K=4時，從圖4中可以看出，在岱山種群(pop1)中，白色占了大部分;在秀山種群(pop2)中，深灰色占了大部分;在朱家尖種群(pop3)中，黑色占了大部分;在舟山本島種群(pop4)中，淺灰色占了大部分，也就是說，根據遺傳信息的不同，各種群中的大部分個體大多集中在根據地理信息來劃分的類群中，說明各種群間已存在一定程度的遺傳差異。

圖4 用種群來源信息進行STRUCTURE分析得到的分配圖(K=4)Fig.4 Inferred clusters based on STRUCTURE analysis using prior information of population origin(K=4)

2.4 獐種群的遺傳分化

遺傳分化系數Gst被認為是反映種群遺傳分化的重要指標，本研究中Gst為0.163，認為有16.30%的遺傳分化發生在種群間，而有83.70%的遺傳分化發生在種群內。當Gst在0—0.05之間，表明種群間遺傳分化程度很弱，0.05—0.15之間表明已有中等程度的分化，0.15—0.25之間表明具有較大的分化，大于0.25表明分化極大［25］，說明實驗中各種群間已存在較大的遺傳分化，AMOVA分析結果也表明，種群間遺傳變異占總變異的11.96%，種群內占88.04%(表4)，兩者結果類似。

表4 獐種群間和種群內分子變異的AMOVA分析Table 4 Analysis of molecular variance(AMOVA)within and among Hydropotes inermis populations

2.5 獐種群間遺傳關系

岱山種群和朱家尖種群間遺傳距離是最大的，為0.066，而秀山種群和舟山本島種群的遺傳距離為0.045，是所有遺傳距離中最近的，其余種群間的遺傳距離介于兩者之間。遺傳相似度與遺傳距離表現為相同的趨勢，舟山本島種群和秀山種群的遺傳相似度是最高的(GI=0.956)，而岱山種群和朱家尖種群的遺傳相似度是最低的，為0.936(表5)。

表5 獐種群間Nei's遺傳距離與遺傳相似度Table 5 Genetic identity and genetic distance among Hydropotes inermis populations

3 討論

3.1 遺傳多樣性

遺傳多樣性在廣義上是指生物所攜帶遺傳信息的總和，在狹義上則是指種內不同種群和個體間的遺傳多態性程度［26］，是種群繁殖和更新的遺傳基礎，可反映一個物種適應環境的能力和對環境變遷持續進化的潛力［27］，是生物多樣性的一個重要方面，因此對遺傳多樣性的研究具有重要意義。在基于ISSR標記的分析中，遺傳多樣性的高低常以Nei′s遺傳多樣性指數(H)和Shannon′s多態信息指數(I)這兩個指標來度量［28］。在利用ISSR標記對哺乳動物的研究中，在物種水平上，高原鼠兔(Ochotona curzoniae)的H為0.2306，I為0.3531［28］，伊朗哈馬丹省常見的一種綿羊的 H 為 0.1258，I為 0.2256［29］;在種群水平上，Askari等［30］曾利用ISSR標記對伊朗科爾曼地區4種16個經濟價值較高的家畜種群進行了遺傳多樣性研究，發現山羊的H為0.0655—0.1052，I為0.1034—0.1604，綿羊的 H 為 0.1052—0.2076，I為 0.2938—0.3058，荷士登乳牛品種的H為0.0891—0.1240，I為0.1449—0.2204，伊朗本地牛的H為0.0950—0.1517，I為0.1481—0.2328。而在本研究中，獐物種水平上的H為0.210，I為0.318;在種群水平上的H為0.157—0.190，I為0.228—0.278，與這些已報道的結果相比較而言，具有相對較高的遺傳多樣性，之前，Hu等［12，13］曾利用線粒體和微衛星標記對野生的舟山獐種群進行研究發現，與其它稀有鹿類動物相比，其遺傳多樣性處于較高的水平。據報道，獐在我國養殖的時間并不是很長，僅有30余年的歷史，最早實現人工飼養的單位是南京動物園，直到20世紀90年代中期，也僅有少數的幾家動物園或大學(如南京動物園，華東師范大學)飼養有少量的獐，主要用于觀賞或科研，直到1997年以后，隨著人們對獐的經濟價值有了認識，以及養殖技術的成熟，養殖獐才得以迅速地發展起來［5］。而舟山地區最早實現獐養殖距今也才20多年的時間，并且，該地區養殖場內的種源大多來自野外，這些可能是舟山養殖獐種群具有相對較高遺傳多樣性水平的原因。

就各種群而言，舟山本島種群的遺傳多樣性表現出最高的水平，這可能與舟山本島的面積最大有關，而在小島上則更容易發生近交，遺傳漂變可導致種群遺傳多樣性的降低［31-32］，而朱家尖島是舟山的第五大島，其面積大于秀山島，但種群的遺傳多樣性卻是最低的，這可能是由于受養殖場規模和實際情況的限制而使得朱家尖島取的樣本量偏少有關，也有可能跟下面提到的與其它島嶼上獐的交流較少有關，對于朱家尖島種群遺傳多樣性偏低的影響因素還有待進一步研究。

3.2 遺傳結構

遺傳結構是指遺傳變異的分布式樣或格局，是生物的基因和基因型在時間和空間上的分布形式［33-34］，其受突變、基因流、自然選擇和遺傳漂變的共同作用，同時還與物種的進化歷史和生物學特征有關［35］，是遺傳學研究的一個重要內容。Structure軟件在揭示種群遺傳結構方面具有較強的直觀性，能反映出種群內或亞群間一定的個體關系，結合一定的種群地理及歷史事件信息，還能揭示一定的種源問題［36］。利用該軟件對59頭獐組成的群體的遺傳結構進行分析，按每頭獐的來源進行聚類(圖4)，結果則顯示，不同地理養殖場的大部分個體已集中在各自獨立的組群中，這暗示各種群間可能已存在一定的分化現象，雖然在這4個種群間表現出有一定的基因混合(圖4中每個種群內混合有4種不同的顏色)，但POPGENE軟件對這4個種群遺傳分化系數的計算結果(Gst=0.163)與各種分化跡象保持了一致性。舟山群島的島嶼生境是生境片段化的一種獨特形式，而片段化生境會影響物種種群間基因交流［37］及物種間相互作用［38-39］。Dixo等［40］發現，巴西熱帶雨林的片段化對生活其中的蟾蜍(Rhinella ornata)間的基因交流造成了影響，Manel等［41］也指出島嶼地理隔離可阻礙基因交流。雖然，獐被認為具有游泳的能力，可達數公里的水域距離［42］，但是這并不代表這種游泳現象時常發生。郭光普和張恩迪［1］曾指出獐的游泳行為并不是主動的，而是迫于諸如種群壓力、資源、偷獵者或家犬的追捕等因素不得已而為之的，這可能也是各種群間存在分化的原因，但也有可能是各個養殖場由于相互隔離的原因造成了分化的現象，總之，不論這些種群之前交流程度如何，從結果上看，現在它們之間已經出現了較高的遺傳分化，并且在今后的種群發展中這些分化可能會更大。

另外我們還計算了各種群間的Nei′s遺傳距離，從結果來看，舟山本島種群(ZS)、秀山種群(XS)和岱山種群(DS)相互間的遺傳距離較近，而朱家尖種群(ZJJ)與其它種群間的遺傳距離較遠。對于朱家尖種群(ZJJ)的遺傳結構出現較大差異的原因有可能是:舟山群島的獐是從舟山本島向整個群島擴散的［1］，即朱家尖的獐最初可能來自于舟山本島，但隨著舟山本島東部普陀區的開發，剛好與朱家尖島相對，繁華的都市阻礙了獐在兩島之間的遷移，即在養殖場建立之前，朱家尖種群與這些種群的基因交流較少，另外，郭光普和張恩迪［1］在對舟山群島獐的分布進行調查時，發現岱山島附近的官山島和小長涂島均有獐的分布，而朱家尖島東側2.2 km的白沙島卻無獐的分布，這也在一定程度上阻礙了朱家尖島獐種群與外界的交流。亦或是各種群養殖前的遺傳情況相差不多，由于養殖后近交程度不同而導致了各養殖場現如今的遺傳格局。結合實際地理分布和各種群間遺傳距離的情況，可認為前者的原因更大。

3.3 獐保護建議

從此次實驗結果上看，各養殖場內的獐種群已出現了較大的遺傳分化，由于在養殖條件下更容易發生近交，在今后的養殖過程中，其分化程度可能會更大，甚至會產生奠基者效應而使基因歧異度趨向相同，不能夠適應多變的環境，而使得這些養殖種群受到更大的淘汰威脅，并給養殖戶帶來巨大的損失，因此，在條件允許的情況下，可以適當補充野外個體，但獐作為國家Ⅱ級重點保護動物，對其野生資源的利用應該盡量減少，我們建議可以在不同養殖場之間進行個體的交流，特別是加強朱家尖島獐種群與其它種群間的交流，這樣也能進一步改善養殖種群的遺傳狀況，但這同時也加重了養殖戶的管理難度，可以結合電子標簽技術對獐個體進行身份編號，并認真記錄個體間的交流情況，這不僅是對獐養殖進行科學管理的有效方式，也是提高養殖品質的基礎。另外，舟山群島作為獐的主要分布區，在合理利用獐的同時，對其野生資源的就地保護也是非常重要的，當前，偷獵行為還比較嚴重，有關部門在加強宣傳教育工作的同時，也要嚴厲打擊破壞野生獐資源的違法行為，并加強棲息地的生態保護，從可持續的角度對獐進行保護和合理利用。

［1］ Guo G P，Zhang E D.The distribution of the Chinese water deer(Hydropotes inermis)in Zhoushan Archipelago，Zhejiang province，China.Acta Theriologica Sinica，2002，22(2):98-107.

［2］ Sun M J，Bao Y X.Investigation on distribution and resources of Hydropotes inermis in Zhejiang province.Journal of Zhejiang Forestry Science and Technology，2001，21(6):20-24.

［3］ Bao Y X.Investigation on Resources of Hydropotes inermis in Zhejiang［A］.Zhejiang Forestry Natural Resources(Terrestrial Wildlife)［C］.Beijing:Science and Technology of Chinese Agriculture Press，2002:307-317.

［4］ Frankham R，Ballou J D，Briscoe D A.Introduction to Conservation Genetics.Cambridge:Cambridge University Press，2002.

［5］ Hu J.Studies on the Conservation Genetics and Reproductive Behavior of Chinese Water Deer［D］.Hangzhou:Zhejiang University，2006.

［6］ Mauget R，Mauget C，Dubost G，Charron F，Courcoul A，Rodier A.Non-invasive assessment of reproductive status in Chinese water deer(Hydropotes inermis):correlation with sexual behaviour.Mammalian Biology-Zeitschrift für S?ugetierkunde，2007，72(1):14-26.

［7］ Dubost G，Charron F，Courcoul A，Rodier A.The Chinese water deer，Hydropotes inermis—A fast-growing and productive ruminant.Mammalian Biology-Zeitschrift für S?ugetierkunde，2011，76(2):190-195.

［8］ Zhang E D，Teng L W，Wu Y B.Habitat selection of the Chinese water deer(Hydropotes inermis)in Yancheng，Jiangsu province.Acta Theriologica Sinica，2006，26(1):49-53.

［9］ Bao Y X，Zhang L L，Sun B，Wei D Z，Shen L L.Habitat characteristics of Chinese water deer(Hydropotes inermis)in spring and autumn in Zhoushan Archipelago，Zhejiang province，China.Acta Theriologica Sinica，2011，31(3):235-243.

［10］ Zhang E，Guo G.Poaching as a major threat to Chinese water deer in Zhoushan Archipelago.Deer，2000，11(8):413-414.

［11］ Teng L W.Population of China Water Deer(Hydropotes inermis)in Yancheng National Nature Reserve and Feasibility of Reintroduction Chinese Water Deer to Shanghai［D］.Shanghai:East China Normal University，2007.

［12］ Hu J，Fang S G，Wan Q H.Genetic diversity of Chinese water deer(Hydropotes inermis inermis):implications for conservation.Biochemical Genetics，2006，44(3/4):156-167.

［13］ Hu J，Pan H J，Wan Q H，Fang S G.Nuclear DNA microsatellite analysis of genetic diversity in captive populations of Chinese water deer.Small Ruminant Research，2007，67(2/3):252-256.

［14］ Zietkiewicz E，Rafalski A，Labuda D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification.Genomics，1994，20(2):176-183.

［15］ Kol N V，Lazebny O E.Polymorphism of ISSR-PCR markers in Tuvinian population of reindeer Rangifer tarandus L.Russian Journal of Genetics，2007，42(12):1464-1466.

［16］ Chen Q，Wang C H，Lu G Q，Song X，Xu J W，Yang Q L，Li S F.Analysis of genetic variation in grass carp(Ctenopharyngodon idellus)from native and colonized regions using ISSR markers.Biochemical Systematics and Ecology，2009，37(5):549-555.

［17］ Fahmi A I，Al-Otaibi S A.Genetic variation in captive herd of Arabian Oryx using RAPD and ISSR markers.African Journal of Biotechnology，2011，10(27):5251-5262.

［18］ Bao Y X，Sun B，Zhang L L，Zhao Q X.The improvement fro method of DNA extraction from animal tissue and PCR detection.Journal of Zhejiang Normal University:Natural Sciences，2009，32(3):317-321.

［19］ Zhang L L，Bao Y X，Yu H H，Xu J，Sun B.Establishment and optimization of ISSR-PCR reaction system and primer screening for Chinese water deer(Hydropotes inermis).Ecological Science，2009，28(4):335-341.

［20］ Francis C Y，Yang R C，Tim B.POPGENE(1.32).http://www.ualberta.ca/～fyeh/download.htm.2000.

［21］ Excoffier L，Laval G，Schneider S.Arlequin(version 3.0):an integrated software package for population genetics data analysis.Evolutionary Bioinformatics Online，2005，1(1):47-50.

［22］ Prichard J K，Stephens M，Donnelly P.Inference of population structure using multilocus genotype data.Genetics，2000，155(2):945-959.

［23］ Falush D，Stephens M，Prichard J K.Inference of population structure using multilocus genotype data:linked loci and correlated allele frequencies.Genetics，2003，164(4):1567-1587.

［24］ Evanno G，Regnaut S，Goudet J.Detecting the number of clusters of individuals using the software STRUCTURE:a simulation study.Molecular Ecology，2005，14(8):2611-2620.

［25］ Buso G S C，Rangel P H，Ferreira M E.Analysis of genetic variability of South American wild rice populations(Oryza glumaepatula)with isozymes and RAPD markers.Molecular Ecology，1998，7(1):107-117.

［26］ Ji W Z，Su B.Principles and Methodologies of Genetic Diversity Studies.Hangzhou:Science and Technology of Zhejiang Press，1998.

［27］ Sun S W，Sun Z X，Ge Y H，Yan D C，Huang Q R.Genetic structure of natural population of Neverita didyma based on ISSR markers.Acta Ecologica Sinica，2008，28(11):5499-5505.

［28］ Ge Y L，Lin G H，Ci H X，Zhang T Z，Tang L Z，Su J P.Genetic diversity and differentiation of Ochotona curzoniae based on ISSR and Cyt b gene.Chinese Journal of Zoology，2009，44(4):34-40.

［29］ Zamani P，Akhondi M，Mohammadabadi M R，Saki A A，Ershadi A，Banabazi M H，Abdolmohammadi A R.Genetic variation of Mehraban sheep using two inter-simple sequence repeat(ISSR)markers.African Journal of Biotechnology，2011，10(10):1812-1817.

［30］ Askari N，Abadi M M，Baghizadeh A.ISSR markers for assessing DNA polymorphism and genetic characterization of cattle，goat and sheep populations.Iranian Journal of Biotechnology，2011，9(3):222-229.

［31］ Emerson B C.Evolution on oceanic islands:molecular phylogenetic approaches to understanding pattern and process.Molecular Ecology，2002，11(6):951-966.

［32］ Guay P J，Chesser R T，Mulder R A，Afton A D，Paton D C，Mccracken K G.East-west genetic differentiation in Musk Ducks(Biziura lobata)of Australia suggests late Pleistocene divergence at the Nullarbor Plain.Conservation Genetics，2010，11(6):2105-2120.

［33］ Loveless M P，Hamrick J L.Ecological determinants of genetic structure in plant populations.Annual Review of Ecology and Systematics，1984，15(1):65-95.

［34］ Li Z C，Wang X L.Understanding and discrimination of several terms in conservation biology(1).Bulletin of Biology，2005，40(10):13-14.

［35］ Zhang Y H，Hou Y，Lou A R.Population genetic diversity of Rhodiola dumulosa in Northern China inferred from AFLP markers.Chinese Journal of Plant Ecology，2010，34(9):1084-1094.

［36］ Parker H G，Kim L V，Sutter N B，Carlson S，Lorentzen T D，Malek T，Johnson G S，Defrance H B，Ostrander E A，Kruglyak L.Genetic structure of the purebred domestic dog.Science，2004，304(5674):1160-1164.

［37］ Fahrig L.Effects of habitat fragmentation on biodiversity.Annual Review of Ecology，Evolution，and Systematics，2003，34(1):487-515.

［38］ Kruess A，Tschamtke T.Species richness and parasitism in a fragmented landscape:experiments and field studies with insects on Vicia sepium.Oecologia，2000，122(1):129-137.

［39］ Knless A.Effects of landscape structure and habitat type on a plant-herbivore-parasitoid community.Ecography，2003，26(3):283-290.

［40］ Dixo M，Metzger J P，Morgante J S，Morgante J S，Zamudio K R.Habitat fragmentation reduces genetic diversity and connectivity among toad populations in the Brazilian Atlantic Coastal Forest.Biological Conservation，2009，142(8):1560-1569.

［41］ Manel S，Schwartz M K，Luikart G，Taberlet P.Landscape genetics:combining landscape ecology and population genetics.Trends in Ecology and Evolution，2003，18(4):189-197.

［42］ Sheng H L，Lu H J.A preliminary study on the river deer population of Zhoushan island and adjacent islets.Acta Theriologica Sinica，1984，4(3):161-166.

參考文獻:

［1］ 郭光普，張恩迪.舟山群島獐的分布.獸類學報，2002，22(2):98-107.

［2］ 孫孟軍，鮑毅新.浙江省獐的分布與資源調查.浙江林業科技，2001，21(6):20-24.

［3］ 鮑毅新.浙江獐資源調查研究.浙江林業自然資源(野生動物卷).北京:中國農業科學技術出版社，2002:307-317.

［5］ 胡杰.獐保護遺傳學及其繁殖行為研究［D］.杭州:浙江大學，2006.

［8］ 張恩迪，滕麗微，吳詠蓓.江蘇鹽城保護區獐的棲息地選擇.獸類學報，2006，26(1):49-53.

［9］ 鮑毅新，張龍龍，孫波，魏德重，沈良良.舟山群島春秋季獐棲息地的生態特征.獸類學報，2011，31(3):235-243.

［11］ 騰麗微.江蘇鹽城沿海灘涂地區獐(Hydropotes inermis)的種群現狀以及重引入上海地區的可行性初步研究［D］.上海:華東師范大學，2007.

［18］ 鮑毅新，孫波，張龍龍，趙慶祥.對動物組織DNA提取方法的改進及PCR檢測.浙江師范大學學報:自然科學版，2009，32(3):317-321.

［19］ 張龍龍，鮑毅新，于華會，許婧，孫波.獐ISSR-PCR反應體系的建立與優化及引物篩選.生態科學，2009，28(4):335-341.

［26］ 季維智，宿兵.遺傳多樣性研究的原理與方法.杭州:浙江科學技術出版社，1998.

［27］ 孫始威，孫振興，葛宜和，閆冬春，黃清榮.基于ISSR標記的扁玉螺(Neverita didyma)自然居群遺傳結構.生態學報，2008，28(11):5499-5505.

［28］ 葛艷麗，林恭華，慈海鑫，張同作，唐利洲，蘇建平.基于ISSR標記和線粒體Cyt b基因分析高原鼠兔的遺傳多樣性及其遺傳分化.動物學雜志，2009，44(4):34-40.

［34］ 李忠超，王小蘭.保護生物學中若干術語的理解和辨析(1).生物學通報，2005，40(10):13-14.

［35］ 張云紅，侯艷，婁安如.華北地區小叢紅景天種群的AFLP遺傳多樣性.植物生態學報，2010，34(9):1084-1094.

［42］ 盛和林，陸厚基.舟山及其鄰近島嶼獐種群的初步研究.獸類學報，1984，4(3):161-166.