食管鱗狀細胞癌細胞及組織中鈣敏感受體基因啟動子區甲基化狀態檢測*

景坤玉，董騰慧，郭明洲，薛樂勛

1)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室 鄭州450001 2)中國人民解放軍總醫院消化科 北京100853#通訊作者，男，1944年2月生，本科，教授，研究方向:腫瘤標志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

食管癌是世界范圍內常見的惡性腫瘤之一，其分布具有明顯的地域差異性:西方國家多為腺癌，而亞洲地區多數為食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma，ESCC)［1-2］。食管癌具體的發病機制尚不十分明確，早期癥狀不典型，多數患者錯過了最佳治療時期。因此，篩選針對食管癌的早期診斷標志物是改善患者生存質量與預后的關鍵。抑癌基因的表觀遺傳學改變，尤其是啟動子區域的異常高甲基化所導致的基因沉默，在腫瘤發生發展中起重要作用。在食管癌的早期病變組織中已經檢測到了多個基因的甲基化異常改變。鈣敏感受體(calcium-sensing receptor，CASR)屬G 蛋白耦聯受體家族成員，定位于染色體3q13，廣泛分布于甲狀旁腺、腎臟、骨和腸等組織，對機體Ca2+穩態的維持起關鍵作用。CASR 的表達異常與多種腫瘤的發生密切相關，如甲狀旁腺腺瘤、乳癌、前列腺癌與結腸癌等［3-4］。已有報道［5］證實其在食管組織及正常食管上皮細胞系中均有表達，但是在食管癌中甲基化狀態與表達的研究尚未見報道。該研究探討了CASR基因在食管癌中啟動子區甲基化狀態的改變，以期尋找食管癌潛在的早期診斷標志物與治療靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 選用的6 株食管癌細胞系(TE8、BIC1、KYSE30、KYSE70、KYSE140、KYSE510)及正常人外周血淋巴細胞均來自中國人民解放軍總醫院消化科實驗室，除BIC1 為食管腺癌外，其余5 株均為ESCC 細胞系。68例食管癌組織標本取自2011年7月至2012年7月安陽市腫瘤醫院手術切除新鮮標本，迅速凍于液氮罐內，后轉至－80℃儲存。其中男53例，女15例;年齡43～78(62.1±8.1)歲，＜60 歲27例，≥60 歲41例;腫瘤位置分別為胸上段20例，胸中段36例，胸下段12例;臨床TNM分期依據1997年國際抗癌聯盟(UICC)標準，Ⅰ、Ⅱ期共50例，Ⅲ、Ⅳ期共18例;有淋巴結轉移24例，無淋巴結轉移44例;術前未經放化療。8例正常食管黏膜組織作為對照，取自于中國人民解放軍總醫院消化內鏡中心非腫瘤患者活檢標本。

1.2 細胞培養及5-氮雜-2'-脫氧胞嘧啶核苷(5-Aza)體外去甲基化處理 6 株食管癌細胞株均在添加體積分數10%胎牛血清(Gbico 公司)及100 kU/L 青霉素、0.1 g/L 鏈霉素(山東魯抗制藥)的RPMI 1640 培養基(Gbico 公司)中培養，培養條件為37℃、體積分數5% CO2。當細胞達到培養瓶底面積70%～80% 融合時，消化收集細胞，提取DNA 及RNA。根據KYSE30、KYSE140、KYSE510 的生長狀況，取部分細胞接種于75 mL 的培養瓶中過夜，向培養基中加入5-Aza(Sigma 公司)至終濃度為2 μmol/L，體外誘導去甲基化。每24 h 更換1 次培養基，96 h 后提取總RNA。

1.3 組織及細胞DNA 與總RNA 的提取 食管癌組織及細胞系的DNA 提取采用蛋白酶K(Sigma 公司)裂解，酚氯仿法抽提，乙醇沉淀后溶于TE 緩沖液。細胞系總RNA 提取采用Trizol(Invitrogen 公司)試劑，在細胞處于對數生長期時提取，紫外分光光度計［A(260nm)/A(280nm)］檢測濃度及純度，瓊脂糖凝膠電泳檢測核酸質量，經篩選后分別保存于－20℃(DNA)與－80℃(RNA)儲存備用。

1.4 DNA 樣本的亞硫酸氫鹽修飾及甲基化特異性PCR(methylation specific PCR，MSP)檢測 取2 μg 的DNA 樣本用亞硫酸氫鹽處理，經DNA Wizard純化試劑盒(Promega 公司)回收，其堿基序列中甲基化的C 不發生改變，非甲基化的C 轉變為U。依據序列的不同設計針對CASR 基因啟動子區的特異性甲基化引物:CASR-MF，5'-GGTTCGGGTTTTTAAG TAGC-3';CASR-MR，5'-TCAAACGTTACCTATACCG C-3';以及非甲基化特異性引物:CASR-UF，5'-TTAG GTTTGGGTTTTTAAGTAGT-3';CASR-UR，5'-TCAAA CATTACCTATACCACAAA-3'，產物大小166 bp。以修飾后DNA 樣本為模板，進行PCR 擴增，檢測CASR 基因啟動子區的甲基化狀況。MSP 反應條件為:95℃5 min;95℃30 s，60℃30 s，72℃40 s，35個循環;72℃7 min。以體外甲基化DNA(in vitro methylated DNA，IVD)作為甲基化陽性對照，以正常人外周血淋巴細胞(normal lymphocyte，NL)DNA 作為陰性對照，以滅菌雙蒸水作為空白對照。

1.5 MSP 結果判定 取MSP 擴增產物10 μL，20 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測。判定原則:若非甲基化引物CASR-U 擴增出條帶，而甲基化引物CASRM 未擴增出條帶，則說明未發生甲基化;若甲基化引物CASR-M 擴增出條帶，而非甲基化引物CASRU 未擴增出條帶，則說明發生完全甲基化;若2 種引物均擴增出條帶，即說明存在部分甲基化。部分甲基化與完全甲基化均認為CASR 啟動子區發生甲基化。

1.6 半定量RT-PCR 檢測細胞系5-Aza 處理前后CASR mRNA 的表達取5 μg 總RNA 用cDNA 第一鏈合成試劑盒(Invitrogen 公司)逆轉錄成cDNA，稀釋5 倍后取2.5 μL 為模板行RT-PCR。CASR 引物 序 列:CASR-F， 5'-CGGGGTACCTTAAGCAC CTACGGCATCTAA-3';CASR-R，5'-GCTCTAGAGT TAACGCGATCCCAAAGGGCTC-3'，產物大小480 bp。以GAPDH 作為內參，GAPDH 引物序列:GAPDH-F，5'-GACCACAGTCCATGCCATCAC-3';GAPDH-R，5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，產物大小454 bp。以滅菌雙蒸水為空白對照。CASR 擴增條件:95℃5 min;95℃30 s，56℃30 s，72℃40 s，38 個循環;72℃5 min。最后取10 μL 的RT-PCR 產物，20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1.7 統計學處理 采用SPSS 13.0 進行數據處理，ESCC 患者的年齡、性別、腫瘤位置、臨床TNM 分期和淋巴結轉移等病理特征與CASR 啟動子區甲基化的關系采用χ2檢驗或校正χ2檢驗進行分析，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 CASR 在食管癌細胞系中的甲基化狀態 6株細胞系MSP 結果顯示:CASR 基因啟動子區在KYSE30、KYSE70、KYSE140、TE8、BIC1 中均發生甲基化，而在KYSE510 中未發生甲基化(圖1)。

圖1 CASR 基因啟動子區在食管癌細胞系中的甲基化狀態

2.2 5-Aza 去甲基化處理對CASR 在食管癌細胞系中表達的調控 半定量RT-PCR 檢測結果顯示，在發生甲基化的食管癌細胞系KYSE30 與KYSE140中，處理前CASR 表達缺失，而5-Aza 處理96 h 后其表達恢復;在未發生甲基化的細胞系KYSE510 中，5-Aza 處理前后表達水平無差異(圖2)。

2.3 CASR 在ESCC組織中的甲基化狀態及其與臨床病理特征的關系

2.3.1 CASR 在ESCC組織中的甲基化狀態 MSP檢測結果顯示，ESCC組織中48例存在甲基化，甲基化率為71%(48/68)，而正常食管黏膜組織中CASR均未檢測到甲基化(0/8)(圖3)。

2.3.2 CASR 的甲基化狀態與ESCC 患者臨床病理特征的關系 CASR 啟動子區甲基化狀態與ESCC患者的年齡構成、性別、腫瘤位置、腫瘤TNM 分期及淋巴結轉移情況等均無關(表1)。

表1 CASR 啟動子區甲基化狀態與臨床病理特征的關系

3 討論

食管癌的具體發病機制尚不十分清楚，近來發現抑癌基因啟動子區CpG 島高甲基化導致的表觀遺傳沉默，涉及細胞周期調控、凋亡、黏附及DNA 損傷修復等多個相關基因的異常表達，可導致抗腫瘤相關信號通路的紊亂［6］，與多種疾病尤其是腫瘤的發生密切相關［7-12］。先前的研究［8，10，12-14］已發現多個在食管癌組織中頻繁發生甲基化的抑癌基因:如PTK6、HIN-1、TFPI-2、SST 和XAF1 等，提示食管癌的發生發展與表觀遺傳學尤其是DNA 甲基化的漸進性改變密切相關。該研究通過MSP 技術分析食管癌的表觀遺傳修飾規律和特點，以期為尋求和發現潛在的腫瘤標志物與早期診斷策略奠定基礎［15］。

CASR 基因定位于染色體3q13，是G 蛋白耦聯受體家族成員，廣泛分布于甲狀旁腺、腎臟、心臟、腸和食管等器官，在維持機體Ca2+及其他金屬離子穩態中起重要作用，其異常表達與甲狀旁腺腺瘤、乳癌、前列腺癌和結腸癌等多種腫瘤的發生密切相關［3］。Hizaki 等［4］研究發現CASR 基因啟動子區頻繁甲基化導致其表達降低或沉默;Liu 等［16］報道維生素D 對于結腸癌的抑制作用依賴CASR 的功能，提示其可能成為食管癌早期診斷、分子靶向治療、化療敏感性或預后等方面重要的評價指標，可通過去甲基化藥物進行表觀遺傳臨床治療逆轉其表達。

因此，探討食管癌組織中CASR 的甲基化改變，有助于篩選針對食管癌的早期診斷標志物，開發組織特異性的治療新方法以及降低抗腫瘤藥物的不良反應，更有效地選擇應對食管癌的策略。

作者利用食管癌細胞系探討CASR mRNA 表達與甲基化之間的關系，檢測了食管正常黏膜組織與ESCC組織中CASR 啟動子區CpG 島的甲基化狀態，并分析甲基化與臨床病理特征的關系。結果顯示5 株食管癌細胞系CASR 啟動子區CpG 島發生甲基化，KYSE30、KYSE140 中CASR 表達缺失，去甲基化藥物5-Aza 處理96 h 后恢復表達;KYSE510 藥物處理前后均正常表達，與甲基化狀態相對應，提示在食管癌細胞系中CASR 啟動子區異常高甲基化并且其表達受到甲基化的調控。68例ESCC組織中CASR 頻繁發生甲基化，甲基化率為71%，8例正常食管黏膜組織中沒有發生甲基化，提示CASR 甲基化具有腫瘤相關性，而排除組織特異性。結合臨床病理特征進行分析發現，CASR 甲基化與ESCC 患者年齡、性別、臨床TNM 分期及淋巴結轉移無關，推測CASR 啟動子區異常高甲基化可能是ESCC 發生的早期事件，與腫瘤的惡性程度無關。

綜上所述，該研究證實CASR 在食管癌細胞系中的表達受到了啟動子區甲基化的調控，其導致的表達沉默可能與食管癌的發生相關。CASR 的啟動子區高甲基化是ESCC組織中頻繁發生的早期事件，其甲基化率高于多數在食管癌發生發展中起重要作用的基因，可能作為食管癌前病變或ESCC 早期篩查的一個潛在標志物，對于ESCC 的防治或者預測ESCC 發生的風險具有重要意義。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61(2):69

［2］Zhang XM，Guo MZ.The value of epigenetic markers in esophageal cancer［J］.Front Med China，2010，4(4):378

［3］Saidak Z，Mentaverri R，Brown EM.The role of the calcium-sensing receptor in the development and progression of cancer［J］.Endocr Rev，2009，30(2):178

［4］Hizaki K，Yamamoto H，Taniguchi H，et al.Epigenetic inactivation of calcium-sensing receptor in colorectal carcinogenesis［J］.Mod Pathol，2011，24(6):876

［5］Justinich CJ，Mak N，Pacheco I，et al.The extracellular calcium-sensing receptor (CaSR)on human esophagus and evidence of expression of the CaSR on the esophageal epithelial cell line (HET-1A)［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2008，294(1):G120

［6］Zhang W，Glockner SC，Guo M，et al.Epigenetic inactivation of the canonical Wnt antagonist SRY-box containing gene 17 in colorectal cancer［J］.Cancer Res，2008，68(8):2764

［7］劉曉梅，邢艷琳，盧巖，等.宮內蛋白營養不良對成年仔鼠肝臟糖皮質激素受體基因啟動子甲基化的影響［J］.實用兒科臨床雜志，2011，26(8):563

［8］Ma S，Bao JY，Kwan PS，et al.Identification of PTK6，via RNA sequencing analysis，as a suppressor of esophageal squamous cell carcinoma［J］.Gastroenterology，2012，143(3):675

［9］李春艷，高文信，周延民，等.口腔鱗狀細胞癌組織中死亡相關蛋白激酶的甲基化及其蛋白的表達［J］.吉林大學學報:醫學版，2009，35(2):341

［10］Guo M，Ren J，Brock MV，et al.Promoter methylation of HIN-1 in the progression to esophageal squamous cancer［J］.Epigenetics，2008，3(6):336

［11］李笑竹，趙貴森，岳陽陽，等.Hela 細胞雄激素受體基因外顯子1 的甲基化檢測［J］.鄭州大學學報:醫學版，2011，46(6):856

［12］Jia Y，Yang Y，Brock MV，et al.Methylation of TFPI-2 is an early event of esophageal carcinogenesis［J］.Epigenomics，2012，4(2):135

［13］田筱青，和水祥.大腸癌中生長抑素基因甲基化研究［J］.西安交通大學學報:醫學版，2012，33(4):515

［14］Chen XY，He QY，Guo MZ.XAF1 is frequently methylated in human esophageal cancer［J］.World J Gastroentero，2012，18(22):2844

［15］高天，梁志清，聶艷麗，等.基于寡核苷酸芯片的β-地中海貧血DNA 甲基化的研究［J］.第三軍醫大學學報，2009，31(24):2469

［16］Liu G，Hu X，Varani J，et al.Calcium and calcium sensing receptor modulates the expression of thymidylate synthase，NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 and Survivin in human colon carcinoma cells:promotion of cytotoxic response to mitomycin C and fluorouracil［J］.Mol Carcinog，2009，48(3):202