杜氏鹽藻鞭毛內運輸蛋白88在鞭毛組裝過程中的功能分析及其原核表達*

韓 康，石 科，毛麗紅，李慶華，龔方華，蔣海麗，薛樂勛1，

1)鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室 鄭州450001 2)鄭州大學第一附屬醫院細胞生物學研究室 鄭州450052#通訊作者，男，1944年2月生，本科，教授，研究方向:腫瘤標志物與基因工程，E-mail:xuelx@zzu.edu.cn

鞭/纖毛內運輸(intraflagellar transport，IFT)是存在于纖毛內部的一種運輸機制，很多纖毛相關蛋白在纖毛內是借助這種機制而實現定向運動，這種運輸主要依靠IFT 復合體，這些復合體能夠通過馬達蛋白和軸絲相連，并負責纖毛內部的多種成分的結合，從而達到運輸的目的［1］。IFT 復合體包含20種以上IFT 蛋白，分別為IFT-A 和IFT-B。IFT 是一種雙向運輸機制，包括基部到頂端的正向運輸和頂端到基部的逆向運輸，其中，IFT-B 主要負責正向運輸，而IFT-A 與貨物的逆向運輸相關［2］，正是這種可控的雙向運輸機制，調控著纖毛有序的組裝、維持和解聚過程。IFT88 是IFT-B 的成分之一，它是由IFT88 基因所編碼的，這種基因能編碼三四氨基酸重復序列(tetratricopeptide repeat，TPR)家族，此重復序列能介導蛋白質之間相互作用［3］，對于IFT88 蛋白的運輸功能起著極其重要的作用。在衣藻細胞內能夠與IFT52、IFT46、HSP40 相互作用;在小鼠中，IFT88 同源蛋白Tg737 的突變會引起多囊腎疾病［4］，且Tg737 的突變與小鼠的視覺、嗅覺的功能障礙也有一定關系［5-6］。杜氏鹽藻是一種高度耐鹽的單細胞且具有雙鞭毛的真核生物，有一對約13 μm的等長鞭毛，生長周期短，培養方式簡單，可作為研究鞭毛的模式生物。作者利用鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室鹽藻轉錄組的已知片段，利用3'RACE 及5'擴增得到IFT88 基因序列，采用實時熒光定量PCR 方法觀察IFT88 mRNA 在杜氏鹽藻鞭毛再生過程中的表達情況。預測并擴增其開放閱讀框后，成功構建其原核表達載體，為進一步的功能分析提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 杜氏鹽藻UTEX LB-1644 購自美國德克薩斯州大學，大腸桿菌DH5α 為鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室保存菌種，載體pMD19-T、EcoR I、Hind Ⅲ等DNA 限制性內切酶及IPTG 均購自大連寶生物工程有限公司;PCR 特異性引物由北京華大基因生物技術有限公司合成;膠回收試劑盒、質粒DNA 小量制備試劑盒購自Axygen 公司，Real Master Mix(SYBR Green)購自天根生化科技(北京)有限公司;HPG400 型光照培養箱購自哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司，紫外分光光度計為Thermo 公司產品，7300 實時熒光定量PCR 儀購自System Applied Biosystems 公司。

1.2 杜氏鹽藻IFT88 cDNA 3' 端序列擴增及拼接根據鄭州大學生物工程系細胞生物學研究室轉錄組測序片段，用Primer Premier 5.0 設計2 個3'RACE上游引物:5'-TTGCGGTTGCTGGAGGTG-3'(18 bp)、5'-CAAGCGTCAGAATTACATCA-3'(20 bp)。下游引物為3'RACE 試劑盒中自帶引物:3'RACE 內側引物5'-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'(32 bp)和3'RACE 外側引物5'-TACCGTCGTTC CACTAGTGATTT-3'(23 bp)。提取對數生長期杜氏鹽藻的總RNA，按照First Choice RLM-RACE Kit 說明進行操作。PCR 反應體系:cDNA 1 μL，上、下游引物(50 μmol/L)各1 μL，dNTP(10 mmol/L)8 μL，10×LA Buffer 10 μL，dH20 補至100 μL。巢式PCR反應產物經10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的片段，與pMD19-T 連接，過夜并轉化至大腸桿菌DH5α，用含有氨芐青霉素抗性、IPTG 和X-Gal 的平板進行藍白斑篩選，挑取陽性菌落培養，提取質粒后經雙酶切鑒定，隨后將菌液送公司測序，將測序結果與原序列進行拼接。

1.3 杜氏鹽藻IFT88 cDNA 5' 端序列擴增及拼接根據拼接的3'端序列，設計5'端下游引物序列，外側引物5'-ATGCCAGCCCAATGTTCC-3'(18 bp)，內側引物5'-GTTTCGCACGAGGTCTGT-3'(18 bp)。上游引物消減雜交文庫特有引物:5'-AAGCAGTGG TATCAACGCAGAGTACXXXXX-3'(X = SMARTer 機密的寡核苷酸序列)(30 bp)，巢式PCR 擴增IFT88 cDNA 的5'端序列，PCR 產物用10 g/L 瓊脂糖凝膠檢測，回收后與pMD19-T 載體連接并轉化至大腸桿菌DH5α，陽性克隆擴大培養。提質粒，EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ雙酶切鑒定，送公司測序后，將測序結果與已知序列進行拼接。

1.4 實時熒光定量PCR 使用機械研磨法去除杜氏鹽藻鞭毛［7］，在去除鞭毛后的180 min 內每30 min 取樣1 次，用Trizol 法提取總RNA，逆轉錄為cDNA 作為模版，設計一對引物5'-ACAGACCTCGT GCGAAAC-3' (18 bp)、5'-ATGCCAGCCCAATGT TCC-3'(18 bp)，以GAPDH 作為內參，進行實時熒光定量PCR，隨后導出數據進行分析。

1.5 驗證開放閱讀框及其原核表達 將拼接序列輸入ORF finder 預測其開放閱讀框，設計原核表達上游引物:5'-CCGGAATTCATGTCGCGCAATGCTGACGA-3'(29 bp);原核表達下游引物:5'-CCCAAGCTTTTATC CCATTGGTAGCAAGT-3'(29 bp)。以制備的cDNA 為模板，利用合成的引物采用PCR 法擴增鹽藻細胞預測的IFT88 開放閱讀框的基因序列。PCR 反應程序:95℃5 min;94℃30 s，40～60℃30 s，72℃150 s，30 個循環;72℃10 min，4℃終止反應。PCR反應結束后，用10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果。將PCR 產物膠回收，連接于pMD19-T 載體上，轉化至大腸桿菌DH5α，挑取陽性菌落培養，雙酶切鑒定后送公司測序。將測序正確的菌液質粒回收，EcoR I、Hind Ⅲ雙酶切后，產物用10 g/L 瓊脂糖凝膠檢測并回收，隨后與pET28a 載體連接，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，進行原核表達。并進一步利用1 mmol/L IPTG，37℃誘導4 h，進行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，觀察表達情況。

2 結果

2.1 杜氏鹽藻IFT88 基因cDNA 3'RACE 結果3'RACE 所得片段膠回收后連接于pMD19-T 得到質粒pMD-I1，經EcoR I、Hind Ⅲ雙酶切鑒定后(圖1)，送公司測序，測序長度約為2 275 bp。

圖1 IFT88 3'RACE 及pMD-I1 的酶切鑒定結果

2.2 杜氏鹽藻IFT88 基因cDNA 5'RACE 結果經5'擴增后得到一條約1 000 bp 的條帶，膠回收后與pMD19-T 載體連接得到質粒pMD-I2，雙酶切鑒定結果見圖2，送公司測序后得到998 bp 核苷酸片段。

圖2 IFT88 5'端擴增及pMD-I2 的酶切鑒定結果

2.3 實時熒光定量PCR 結果 結果見圖3。與未去除鞭毛組比較，在去除鞭毛后的180 min 內，IFT88 基因的轉錄量在30 min 時達到了對照組的4倍，隨后轉錄水平迅速降低，與鹽藻鞭毛生長速率曲線基本一致。

2.4 pET28a-IFT88 載體構建及其原核表達結果擴增得到開放閱讀框約2 400 bp(圖4A)，公司測序結果顯示序列無誤，編碼799 個氨基酸，BLAST 顯示該氨基酸序列與多個物種的IFT88 有較高同源性。膠回收片段，與pET28a 載體連接后，轉化至大腸桿菌BL21(DE3)中，與pET28a 載體連接后得到質粒pET28a-IFT88，質粒雙酶切鑒定結果見圖4B。SDSPAGE 顯示37℃、1 mmol/L IPTG 誘導4 h 后在約90 000處有明顯高表達(圖5)。

3 討論

經測序拼接后，得到IFT88 開放閱讀框2 400 bp，編碼799 個氨基酸，通過DNAMAN 軟件對該序列分析得到IFT88 蛋白的相關信息，其蛋白質的相對分子質量為87 907.4，等電點為5.08。在NCBI上比對IFT88 氨基酸序列，發現其具有IFT88 家族所特有的結構域(TPR 結構域)，且與其他物種的IFT88 氨基酸序列有較高的同源性(衣藻58%、斑馬魚40%、短尾負鼠40%、黑猩猩43%、人類38%)，可見此蛋白序列比較保守。

自Pazour 等［4］發現衣藻IFT88 小鼠同源蛋白Tg737 斷裂可以縮短腎臟纖毛并引起多囊腎病以來，關于IFT88 研究越來越多。IFT88 的缺失會導致纖毛缺陷，這種缺陷會導致多囊腎疾病、視覺、嗅覺的功能障礙等多種纖毛疾病，此外，IFT88 在細胞有絲分裂中與紡錘體的定位相關聯［8］，并且在無纖毛細胞中，IFT88 還能調節細胞G1-S 的轉變［9］。雖然關于IFT88 和纖毛疾病的研究已經很多，但是導致這種病變的機制仍不清楚，并且關于纖毛的組裝、維持和解聚的機制也有待探究。作者不僅克隆了IFT88 的開放閱讀框而且構建其原核表達載體對此蛋白進行誘導表達，又通過實時熒光定量PCR 觀察在轉錄水平上IFT88 與杜氏鹽藻鞭毛再生的關系，此實驗為進一步純化IFT88 蛋白、制備抗體及研究IFT88 在鞭毛中的相互作用奠定了基礎。

［1］曹木青，潘俊敏.纖毛及纖毛相關疾病研究進展［J］.中國細胞生物學學報，2012，34(9):849

［2］Cole DG，Snell WJ.Snapshot:intraflagellar transport［J］.Cell，2009，137(4):784

［3］Hao L，Schole JM.Intraflagellar transport at a glance［J］.J Cell Sci，2009，122(Pt 7):889

［4］Pazour GJ，Dickert BL，Vucica Y，et al.Chlamydomonas IFT88 and its mouse homologue，polycystic kidney disease gene tg737，are required for assembly of cilia and flagella［J］.J Cell Biol，2000，151(3):709

［5］McIntyre JC，Davis EE，Joiner A，et al.Gene therapy rescues cilia defects and restores olfactory function in a mammalian ciliopathy model［J］.Nat Med，2012，18(9):1423

［6］Pazour GJ，Baker SA，Deane TA，et al.The intraflagellar transport protein，IFT88，is essential for vertebrate photoreceptor assembly and maintenance［J］.J Cell Biol，2002，157(1):103

［7］王翠，李杰，柳麗平，等.杜氏鹽藻寡糖基轉移酶亞基STT3α 功能結構域的克隆與表達分析［J］.生物工程學報，2010，26(6):760

［8］Delaval B，Bright A，Lawson ND，et al.The cilia protein IFT88 is required for spindle orientation in mitosis［J］.Nat Cell Biol，2011，13(4):461

［9］Robert A，Margall-Ducos G，Guidotti JE，et al.The intraflagellar transport component IFT88/polaris is a centrosomal protein regulating G1-S transition in non-ciliated cells［J］.J Cell Sci，2007，120(Pt 4):628