銀杏內酯B對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織Caspase－3及VEGF mRNA表達的影響*

王 軍，尚鳳偉，朱登納，王寶珍，張冬秀，張貞煥，馬潔瓊

鄭州大學第三附屬醫院腦癱康復科 鄭州450052

△女，1963年7月生，博士，教授，主任醫師，研究方向:小兒神經疾病的康復治療，E-mail:swangjun@zzu.edu.cn

缺氧缺血性腦損傷(hypoxic-ischemic brain damage，HIBD)是圍產期導致新生兒死亡及遺留神經系統后遺癥的重要原因，目前各種治療方法療效有限。銀杏內酯B(ginkgolide B，GB)是銀杏葉提取物中主要的藥效成分之一，為二萜類酸化合物，廣泛用于心腦血管、中樞神經系統疾病。有研究［1］表明，GB 對短暫性及永久性局灶性大腦中動脈阻塞模型大鼠和小鼠均具有保護作用。Caspase-3 是介導細胞凋亡的關鍵分子，在凋亡信號傳導的許多途徑中發揮作用。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種內皮細胞特異的強效有絲分裂原，有促內皮細胞生長的作用，可誘導血管及淋巴管的生成，因此VEGF 的表達對改善腦缺血灶周圍的側支循環，促進腦功能的恢復具有重要意義。作者觀察了GB對HIBD 新生大鼠腦組織Caspase-3 和VEGF mRNA表達的影響，為臨床應用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與材料 清潔級新生7 d 齡健康SD大鼠96 只，體質量12～16 g，由河南省實驗動物中心提供;GB 購于中國科學院生物藥品檢定所;體積分數8%O2+體積分數92%N2混合氣體購于北京普萊克斯氣體公司;Trizol(Invitrogen 公司);逆轉錄試劑盒及熒光定量PCR 儀(SYBR GreenⅠ染料法)，北京康為世紀公司;熒光定量PCR 儀，美國Applied Biosystems 公司。

1.2 實驗分組 動物按隨機數字表法分為假手術組(n=24)、模型組(n =24)、GB 低劑量組(n =24)及GB 高劑量組(n =24)。模型組、GB 低劑量組及GB 高劑量組采用經典Rice 法［2］制作HIBD 動物模型:乙醚麻醉后將動物置于手術臺上，分離并兩端結扎左側頸總動脈，中間剪斷，術后放回母鼠身邊恢復0.5～1.0 h 后，放入常壓缺氧箱中，箱內放置鈉石灰，用以吸收動物排出的CO2，以1.0～1.5 L/min的速度向容器內輸入混合氣體，持續2.5 h 后，放回母鼠身邊繼續飼養。假手術組只分離不結扎左側頸總動脈，不行缺氧處理。模型制作4 h 后，GB 低劑量組及GB 高劑量組分別以5 和10 mg/kg 腹腔注射GB，給藥容積10 mL/kg，余2組給等量生理鹽水，1次/d，共5 d。

1.3 標本取材 造模后第3、7、14 及28 天，各組分別隨機抽取6 只大鼠處死，處死前稱質量，斷頭取腦，取左側腦組織分裝于凍存管中，立即置液氮中快速冷凍，隨后于－80℃冰箱保存。

1.4 腦組織Caspase-3 和VEGF mRNA 的檢測采用熒光定量PCR 法。腦組織標本在液氮中研磨，按Trizol 試劑及逆轉錄試劑盒說明書抽提RNA，逆轉錄合成cDNA 后，進行PCR 擴增。根據GenBank中β-actin 及目的基因序列，利用Primer 5.0 設計引物，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成(表1)。采用兩步法PCR 反應，反應條件:95℃預變性10 min，(95℃變性15 s+60℃退火延伸1 min)×35 個循環，得到每個樣品的Ct 值。采用2－ΔΔCt法計算目的基因的表達量，ΔΔCt=(Ct目的基因－Ct內參)實驗組－(Ct目的基因－Ct內參)對照組。

表1 PCR 引物序列及產物

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0 進行數據分析，不同時間、同一時間點4組間腦組織Caspase-3 與VEGF mRNA 表達量的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 法檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 動物一般情況 動物缺氧過程中出現躁動、翻滾、皮膚發紺、頭部顫動等表現。HIBD 后動物出現不同程度的行為學異常，如喂養困難、活動減少、體質量增長緩慢等。實驗過程中沒有動物死亡。

2.2 4組大鼠腦組織Caspase-3 與VEGF mRNA的表達 熒光定量PCR 產物瓊脂糖凝膠電泳圖見圖1。模型組、GB 低劑量組及GB 高劑量組Caspase-3 mRNA 的表達均于造模后第3 天達最高，此后逐漸下降，第28 天時接近基線水平。這3組VEGF mRNA 的表達于造模后第3 天達最高，此后下降，模型組下降較快，GB 低劑量組及GB 高劑量組下降趨勢相對緩慢。假手術組兩個指標各時間點表達差異無統計學意義。見表2、3。

圖1 實時熒光定量PCR 產物的瓊脂糖凝膠電泳圖

表2 4組大鼠腦組織Caspase-3 mRNA 的表達

表3 4組大鼠腦組織VEGF mRNA 的表達

3 討論

新生兒HIBD 是導致新生兒腦損傷及后遺腦性癱瘓的常見原因，近年來由于高危妊娠增多及新生兒搶救成功率的提高，HIBD 的發病率有增高趨勢，但目前對此病的治療效果不佳［3-5］。GB 是從銀杏葉中提取的一種天然的血小板活化因子(plateletactivating factor，PAF)受體拮抗劑，是銀杏內酯中神經保護作用最顯著的成分之一，有抗氧化、抗炎及抗細胞凋亡作用［6-7］。季秋虹等［8］用GB 預處理原代培養的小鼠皮層神經元，再進行嚴重缺血損傷處理，觀察神經元Caspase-3 蛋白表達的變化，發現GB 預處理可促進缺血神經元增殖，抑制Caspase-3 的活化，降低神經細胞凋亡比率。HIBD 后神經細胞中伴有多種凋亡相關基因的表達及蛋白的合成，Caspase-3 作為細胞凋亡最關鍵的效應蛋白酶，在損傷區的細胞凋亡過程中起決定性作用［9］。研究［10］表明正常人腦神經元中幾乎無Caspase-3 蛋白表達，而在腦缺血時神經元中Caspase-3 蛋白表達明顯升高［11-12］。

該研究結果顯示，模型組大鼠HIBD 后第3 天腦組織Caspase-3 表達明顯增加，此后雖逐漸降低，但直到術后第28 天仍高于假手術組;GB 高、低劑量組HIBD 后腦組織Caspase-3 表達較模型組明顯降低，其中高劑量組降低更加顯著。說明HIBD 后腦組織Caspase-3 表達上調，細胞凋亡增加;應用GB后可顯著下調Caspase-3 的表達，減少細胞凋亡，從而減少腦損傷。Hostettler 等［13］在培養星形膠質細胞和少突膠質細胞時加入0.02～2.00 mg PAF，72 h后細胞死亡增多，加入GB 可顯著減少細胞死亡，而各種濃度的PAF 均可使Caspase-3 表達增多，這與該研究結果相一致。作者的觀察結果還顯示HIBD誘導的細胞凋亡可持續至傷后4 周甚至更久，因此臨床治療此類疾病時可適當延長治療的時間窗。

VEGF 是一類促進血管再生，增加血管通透性的細胞因子，調控其表達的因素很多，缺血或低氧是誘導VEGF 表達的最主要因素［14］。有研究［15］發現，GB 可顯著上調星形膠質細胞VEGF mRNA 的表達。該研究發現，模型組大鼠HIBD 后，腦組織VEGF 的表達明顯增加，術后第14 天才降至正常水平;GB 高、低劑量組腦組織同時間點VEGF 的表達較模型組增加，高劑量組的效果更顯著，直到術后第28 天仍高于正常水平。腦缺血發生時，VEGF 表達增加對損傷腦組織起著多重修復作用，涉及促進血管形成、誘導神經發生、直接的神經營養和保護作用及抗凋亡等多重機制［16-18］。該研究結果提示:GB可能通過上調VEGF 的表達，促進腦損傷區血管的形成，改善細胞微環境，發揮神經營養及保護作用，并對損傷區神經干細胞的增殖遷移產生積極的影響，從而對損傷腦組織進行修復。

綜上所述，GB 可以下調腦損傷誘導的Caspase-3 表達，上調VEGF 表達，從而降低腦損傷后細胞凋亡并改善損傷區微環境，促進腦損傷的修復，高劑量效果更加明顯。這將為HIBD 的治療提供新的思路，為GB 的臨床應用提供了理論依據。

［1］黃賤英，孫建寧，梅世昌，等.銀杏內酯B 對缺血/再灌腦損傷大鼠的保護作用［J］.中國藥理學通報，2008，24(2):269

［2］Rice JE 3rd，Vannucci RC，BrieHey JB.The influence of immaturity on hypoxic-ischemic brain damage in the rat［J］.Ann Neurol，1981，9(2):131

［3］Selway LD.State of the science:hypoxic ischemic encephalopathy and hypothermic intervention for neonates［J］.Adv Neonatal Care，2010，10(2):60

［4］鄒崢，劉小惠，鄒大衛.缺氧缺血性腦損傷［J］.實用兒科臨床雜志，2011，26(18):1446

［5］喬麗麗，沈偉勤，陳國宏，等.褪黑素對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠的保護作用［J］.實用兒科臨床雜志，2011，26(15):1204

［6］Maclennan KM，Darlington CL，Smith PF.The CNS effects of Ginkgo biloba extracts and ginkgoide B［J］.Prog Neurobiol，2002，67(3):235

［7］Xia SH，Fang DC.Pharmacological action and mechanisms of ginkgolide B［J］.Chin Med J (Engl)，2007，120(10):922

［8］季秋虹，吳小梅，李建成，等.銀杏內酯B 抗缺血神經元凋亡的預適應作用［J］.中風與神經疾病雜志，2008，25(5):520

［9］Adamczyk A，Kazmierczak A，Czapski GA，et al.Alpha-synuclein induced cell death in mouse hippocampal (HT22)cells is mediated by nitric oxide-dependent activation of caspase-3［J］.FEBS Lett，2010，584(15):3504

［10］趙彥坡，秦潔，孫石磊.美金剛對大鼠腦缺血再灌注后Caspase-3 表達及丙二醛含量的影響［J］.鄭州大學學報:醫學版，2011，46(5):748

［11］Nakajima W，Ishida A，Lange M，et al.Apoptosis has a prolonged role in the neurodegeneration after hypoxic ischemia in the newborn rat［J］.J Neurosci，2000，20(21):7994

［12］Davoli MA，Fourtounis J，Tam J，et al.Immunohistochemical and biochemical assessment of caspase-3 activation and DNA fragmentation following transient focal ischemia in the rat［J］.Neuroscience，2002，115(1):125

［13］Hostettler ME，Knapp PE，Carlson SL.Platelet activating factor induces cell death in cultured astrocytes and oligodendrocytes:involvement of Caspase-3［J］.Glia，2002，38(3):228

［14］Tiyyagura SR，Pinney SP.Left ventricular remodeling after myocardial infarction:past，present and future［J］.Mt Sinai J Med，2006，73(6):840

［15］徐倩，張艷軍，劉洋，等.銀杏內酯B 作用于星形膠質細胞對神經干細胞趨化影響的體外研究［J］.天津中醫藥，2010，27(5):421

［16］Obrenovitch TP.Molecular physiology of preconditioninginduced brain tolerance to ischemia［J］.Physiol Rev，2008，88(1):211

［17］Storkebam E，Larnbrechts D，Carmeliet P.VEGF:once regarded as a specific angiogenic factor，now implicated in neuropfotection［J］.Bioessays，2004，26(9):943

［18］Namiecinska M，Marciniak K，Nowak JZ.VEGF as an angiogenic，neurotrophic，and neuroprotective factor［J］.Postepy Hig Med Dosw，2005，59:573