THP-1細胞系白血病干細胞的檢測、分選及鑒定

王穎超，馮 磊，殷楚云，魏永緯，馬麗娜，王春美，盛光耀

鄭州大學第一附屬醫院兒科;河南省高等學校臨床醫學重點學科開放實驗室 鄭州450052

△男，1970年12月生，碩士，副教授，研究方向:兒童血液與腫瘤方向，E-mail:yingchaowang152@163.com

急性白血病(acute leukemia，AL)是起源于造血干細胞的惡性克隆性疾病，發病率較高，在兒童和青少年惡性腫瘤中發病率居首位［1］，其中兒童急性髓細胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)治療難度較大(除隱性早幼粒細胞白血病外)，雖然目前完全緩解率顯著提高［2］，但耐藥和復發仍然非常普遍，長期生存率更低［3］。AML 與干細胞關系非常密切，白血病患者體內存在極小一群非常特殊的細胞，即白血病干細胞(leukemia stem cells，LSCs)，LSCs對常規的化療藥物不敏感，AML 的發生、復發均與這一小群LSCs 有關［4］。作者以人急性單核細胞白血病THP-1 細胞為研究對象，通過流式細胞術檢測、分選CD34+CD38－的細胞，并進一步觀察其生物學特性，為下一步深入研究LSCs 的特異表面標志分子和靶向治療等后續工作打下基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、細胞株及試劑 非肥胖糖尿病/重癥聯合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠40 只，6～8 周齡，雌雄不限，體質量約15 g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。THP-1 細胞購自中科院上海細胞庫研究所。碘化丙啶(PI)、阿糖胞苷(Sigma 公司，美國)，青、鏈霉素(索萊寶公司，中國)，改良型RPMI 1640 培養基、優級胎牛血清(Hyclone 公司，美國)，小鼠抗人CD34-PE 單克隆抗體、小鼠抗人CD38-FITC 單克隆抗體、小鼠抗人IgG1-PE、小鼠抗人IgG1-FITC(eBioscience 公司，美國)，組織RNA 提取試劑盒(Biomiga 公司，美國)，MMLV 逆轉錄試劑盒、PCR 擴增試劑盒(Fermentas 公司，立陶宛)，DNA Marker、引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.2 細胞培養 THP-1 細胞用含體積分數20%胎牛血清、體積分數1%青鏈霉素的RPMI 1640 完全培養基，在37℃、體積分數5%CO2的細胞培養箱內培養，每隔48 h 換液傳代。

1.3 LSCs 的檢測及分選 取對數生長期的THP-1細胞，1 500 r/min 離心10 min，離心2 次，加PBS 制成單細胞懸液(106mL－1)，加入3 只試管，分別加入以下單克隆抗體試劑:鼠抗人CD34-PE 和鼠抗人CD38-FITC，同型對照分別加入IgG1-PE、IgG1-FITC，同時設置陰性對照。充分混勻后4℃下避光染色20 min。染色完成后1 000 r/min 離心10 min，洗滌2 次，加入PBS 稀釋樣本至500 μL，重懸細胞，上流式細胞儀測定，采用CELLQUEST 軟件分析。打開分選軟件，設置左右收集的細胞群;換上偏振板，調整參數，使偏振板在最佳位置，打開左、右分選通道，使左右兩條液流分開，開始分選;待收集結束，離心收集細胞。重復測量10 次。

1.4 細胞周期的檢測 取分選后的LSCs組、非LSCs組單細胞懸液，離心洗滌，加入配好的PI 及透膜劑，室溫下避光孵育20 min，10 g/L 多聚甲醛固定24 h 以上，上機前過濾細胞以防部分聚集成團的細胞堵管。收集10 000 個細胞，記錄并分析G0/G1、S和G2/M 期細胞的比例。

1.5 ABCG2、ABCB1、Bcl-2、Bax 基因表達的檢測采用實時熒光定量PCR 方法，根據試劑盒說明書對分選后LSCs 和非LSCs 提取總RNA，逆轉錄合成第一鏈cDNA 后－70℃保存或直接進行熒光定量PCR 反應，以GAPDH 為內參。使用ABI7500 光定量PCR 儀進行擴增。GAPDH 上游引物序列5'-AC CACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列5'-TC CACCACCCTGTTGCTGTA-3';ABCG2:上游引物序列5'-GTCTAAGCAGGGACGAACAATC-3'，下 游 引 物 序列5'-GCCAATAAGGTGAGGCTATCAA-3';ABCB1 上游引物序列5'-TGGTGTTTGGAGAAATGACAGAT-3'，下游引物序列5'-GAAACCTGAATGTAAGCAGCAAC-3';Bcl-2 上游引物序列5'-GTGGATGACTGAATAC CTGAACC-3'，下游引物序列5'-AGACAGCCAG GAGAAATCAAAC-3';Bax 上游引物序列5'-GGTT GTCGCCCTTTTCTACTT-3'，下游引物序列5'-GT GAGGAGGCTTGAGGAGTCT-3'。反應體系反應條件:98℃預變性2 min;98℃變性10 s，55℃退火15 s，72℃延伸40 s，40 個循環;72℃再延伸8 min。

1.6 NOD/SCID 小鼠白血病模型建立 將35 只NOD/SCID 小鼠隨機分成7組，每組5 只，A～C組經尾靜脈分別注射104、105、106個非LSCs;D～F組分別注射103、104、105個LSCs;G組(陰性對照組)經尾靜脈或腹腔注射無菌PBS，注射劑量均為0.2 mL。自接種日起每日觀察小鼠成瘤情況，記錄各組小鼠生存時間。

1.7 統計學處理 采用SPSS 17.0 處理數據。應用兩獨立樣本的t 檢驗比較LSCs組、非LSCs 細胞周期及ABCG2、ABCB1、Bcl-2、Bax 基因水平的差異。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 LSCs 的分選 重復測量10 次，THP-1 細胞株中存在免疫表型為CD34+CD38－的LSCs，比例為(0.12±0.06)%;收集分選后LSCs 管細胞再次上流式細胞儀進行檢測，細胞集中于之前的LSCs 區域，比例為(97.00±1.70)%。

2.2 LSCs 細胞和非LSCs 細胞細胞周期分析 見表1。

表1 細胞周期分析 %

2.3 LSCs 細胞和非LSCs 細胞不同基因表達水平的比較 見表2。

表2 LSCs 細胞和非LSCs 細胞不同基因表達水平的比較

2.4 不同分組小鼠成瘤情況比較 小鼠在接受不同處理后，除E組和G組各有1 只在觀察過程中死亡，余均存活4 周以上。1×103數量的LSCs 可在4周后形成典型的NOD/SCID 小鼠白血病浸潤模型，非LSCs 至少需要1×106才能成瘤，成瘤率遠低于LSCs 移植組。LSCs組小鼠多在發病后1～2 周內死亡，平均生存時間為(31±2)d，而非LSCs組平均生存時間為(39±2)d，差異有統計學意義(t =7.124，P ＜0.001)。

3 討論

LSCs 因具有自我更新、多向分化和無限增殖的能力，可能是導致白血病耐藥及復發的根源［5］。然而，由于缺乏高度特異的細胞免疫表型，使得LSCs的分離純化一直是亟待解決的難題之一。Feller等［6］報道了免疫表型為CD133+和(或)CD34+的人AML LSCs。LSCs 細胞表型可能還包括CD123［7］、CD96［8］、CLL-1［9］、CD47［10］、CD44［11］等。諸多LSCs免疫表型存在爭議，但是CD34、CD38 仍作較經典的白血病起始細胞表面標志被許多研究所采用。該研究結果顯示，在對數生長期的THP-1 細胞中，CD34+CD38－細胞的比例為(0.12±0.06)%。

研究［12］發現，90%以上的LSCs 處于細胞分裂周期的G0期，干細胞生長因子等一般難以把這些LSCs 從G0期活化刺激進入細胞增殖周期。該研究也發 現，LSCs G0/G1期 細 胞 比例 達(94.03±1.61)%，明顯高于非LSCs，初步證實在THP-1 細胞中確有小部分細胞處于細胞周期中的靜止狀態，即LSCs。這些LSCs 比普通白血病細胞更能有效地抵御化療藥物的傷害，并能產生藥物耐受。

ABC 轉運體的高表達可以將許多抗腫瘤藥物逆向轉運出到細胞外，使抗腫瘤藥物不能進入到細胞內積聚發揮作用，也是LSCs 耐藥的主要原因之一。AML 患者中LSCs 相對于骨髓造血干細胞有更高的ABC 轉運體相關基因ABCB1 和ABCG2 的表達［13］。該研究結果顯示:LSCs 亞群ABCG2 和ABCB1 基因的表達水平明顯高于非LSCs 亞群，亦證實了這一點。

凋亡逃逸也是造成LSCs 耐藥的主要原因之一［14］。Bcl-2/Bax 比例上調在腫瘤的發生和發展中有著極為重要的意義［15-16］。該研究顯示，與非LSCs比較，LSCs 亞群Bcl-2 的相對表達量增加，雖然Bax的表達在兩亞群細胞中差異無統計學意義，但是，LSCs 亞群Bcl-2/Bax 比值顯著升高。這一結果表明LSCs 比非LSCs 具有更強的凋亡逃逸現象，在臨床上表現為對誘導凋亡藥物不敏感，從而導致復發。

LSCs 不同于正常干細胞最顯著的一點是具有高致瘤性，作者建立模型后發現:103的LSCs 早期(接種后3 周)即可在NOD/SCID 小鼠檢測到白血病細胞。而非LSCs組至少需要106個細胞才能成瘤，而且發病時間晚，這說明LSCs 亞群侵襲性更高，具有高致瘤性。

綜上所述，THP-1 細胞中存在小部分細胞，該部分細胞具有CD34+CD38－細胞免疫表型，處于靜止的周期狀態，高表達耐藥基因和抗凋亡基因，具有干細胞的生物學特性及體內致瘤性。

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