三個亨廷頓舞蹈病家系APEX基因氧化還原功能區變異檢測

周 璐，姜 楠，魏志茹，陳文哲，申夢姣，崔健健，李曉文

1)鄭州大學臨床醫學系 鄭州450052 2)鄭州大學基礎醫學院細胞生物學與醫學遺傳學教研室 鄭州450001

#通訊作者，女，1955年8月生，本科，教授，研究方向:遺傳病的分子機制與基因診斷，E-mail:Lixiaowen@zzu.edu.cn

亨廷頓舞蹈癥(Huntington's disease，HD)是以神經系統退行性改變為主要特征的常染色體顯性遺傳病，主要由于IT15 基因CAG 重復序列異常擴增，導致其所編碼的亨廷頓蛋白結構與功能異常［1］。臨床上表現為慢性進行性加重舞蹈樣動作、認知及精神障礙的“三聯征”，多在30 至40 歲發病，患病后15～20 a 死亡。脫嘌呤/嘧啶核酸內切酶(aprimidinic/apurinic endonuclease/redoxfactor-1，APEX)是堿基切除修復途徑的關鍵酶之一，并作為一種多功能蛋白，在一些神經系統病變中發揮著重要的作用。該研究初步探討APEX 基因氧化還原功能區變異與亨廷頓舞蹈癥發生的相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象 3 個HD 家系均來自河南省，獲知情同意后，共抽取26例正常個體和10例HD 患者外周靜脈血各3 mL，所有受檢者均經IT15 基因診斷。

1.2 APEX 基因變異的檢測 采用單鏈構象多態性(SSCP)檢測。采用酚-氯仿法提取基因組DNA。APEX 基因(ACCESSION:M92444)氧化還原功能區序列來源于GenBank，利用Primer 軟件，設計第1～3 外顯子的擴增引物(表1)。3 個外顯子的多態性位點在Genewindow 查得:E1 有8 個多態性位點，E2 不含多態性位點，E3 有5 個多態性位點。引物合成由上海生工公司完成。

表1 PCR 擴增引物及擴增片段長度

反應體系共20 μL:Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模版2 μL，ddH2O 6 μL。PCR 反應條件:95℃預變性5 min，94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，30 個循環;然后在72℃條件下延伸7 min;4℃保存。制備8 g/L 非變性聚丙烯酰胺凝膠(交聯比為49:1)，0.5×TBE 預電泳30 min。將PCR 產物加樣電泳，130 V 電壓12 h，銀染顯色。數碼相機拍照并制成干膠保存。患者和家系正常個體擴增產物由北京金唯智生物公司測序。

2 結果

所有樣本APEX 基因的3 個外顯子擴增片段均未發現異常電泳條帶。將3 個家系內的正常個體和HD 患者的擴增產物進行DNA 測序和比對，正常個體與HD 患者之間未發現差異，部分結果見圖1、2。

3 討論

HD 的病理改變表現為具有高度區域選擇性的腦萎縮和神經元脫失。化學性質活潑的自由基是腦缺血再灌注、阿爾茨海默病和肌萎縮性側索硬化癥等神經退行性疾病、腦動脈粥樣硬化等神經系統病變的重要原因之一［2-4］，APEX 可作為調節真核細胞基因表達的氧化還原信號傳導蛋白［5］，影響著氧化應激下的細胞生存，在上述神經系統病變中發揮著重要的作用［6］。作者檢測亨廷頓舞蹈病家系成員中APEX 基因氧化還原功能區，以探討亨廷頓舞蹈病的發生中是否有該基因變異。

1989年日本Orita 等［7］最早使用SSCP 技術。通過非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳［8］，可以非常敏銳地將構象上有差異的分子分離開。結合PCR 技術，可靈敏地檢測已知突變，篩選未知突變。該研究采用SSCP-DNA 測序的方法檢測亨廷頓舞蹈病家系成員中APEX 基因氧化還原功能區的3 個外顯子，可檢測多個多態性位點的改變，避免了酶切技術造成的大工作量。

DNA 損傷存在多種修復機制，包括堿基切除修復、核苷酸切除修復、錯配修復和重組修復等，其中堿基切除修復(base excision repair，BER)是糾正自發突變和外源性活性化合物引起DNA 損傷的最活躍途徑，在維持遺傳物質穩定性方面具有重要作用。Jakupciak 等［9］認為:DNA 合成中，DNA 復制叉遇到CTG 或CAG 重復序列時會在2 條鏈上形成斷裂，并產生40～400 個重復單位的缺口，啟動重組修復過程。APEX 是BER 修復途徑的限速酶［10］，與DNA 聚合酶、連接酶等相互作用，促進DNA 的修復。APEX 可在AP 部位的5'端切斷DNA 鏈，亦可在3'磷酸殘基形成3'-羥基引物，參與長補丁修復。APEX 修復功能的缺失可導致基因突變和微衛星不穩定。該研究結果未見HD 患者APEX 基因變異，表明該基因氧化還原功能區變異不是導致HD 患者IT15 微衛星序列異常擴增的危險因素。

［1］高歌，陳曉蕾，付汪星，等.兩個亨廷頓舞蹈病家系IT15基因(CAG)n 檢測［J］.鄭州大學學報:醫學版，2010，45(6):936

［2］Kawase M，Fujimura M，Morita-Fujimura Y，et al.Reduction of apurinic/apyrimidinic endonuclease expression after transient global cerebral ischemia in rats :implication of the failure of DNA repair in neuronal apoptosis［J］.Stroke，1999，30 (2):441

［3］Shaikh AY，Martin LJ.DNA base-excision repair enzyme apurinic/apyrimidinic endonuclease/redox factor-1 is increased and competent in the brain and spinal cord of individuals with amyotrophic lateral sclerosis［J］.Neuromolecular Med，2002，2(1):47

［4］Hall JL，Wang X，Van Adamson，et al.Overexpression of Ref-1 inhibits hypoxia and tumor necrosis factor-induced endothelial cell apoptosis through nuclear factor-κB independent and dependent pathways［J］.Circ Res，2001，88(12):1247

［5］陳欣，劉艷霞.APE/Ref-1 在中樞神經系統氧化應激反應中的保護作用［J］.中國生物化學與分子生物學報，2006，22(5):355

［6］Prabhakar NR，Kumar GK，Nanduri J，et al.ROS signaling in systemic and cellular responses to chronic intermittent hypoxia［J］.Antioxid Redox Signal，2007，9(9):1397

［7］Orita M，Suzuki Y，Sekiya T，et al.Rapid and sensitive detection of point mutations and DNA polymorphisms using the polymerase chain reaction［J］.Genomics，1989，5:874

［8］樂曉萍，杜鵬，張欽憲，等.聚丙烯酰胺凝膠銀染技術改良［J］，鄭州大學學報:醫學版，2001，36(4):395

［9］Jakupciak JP，Wells RD.Gene conversion (recombination)mediates expansions of CTG［middle dot］CAG repeats［J］.J Biol Chem，2000，275(51):40003

［10］Evns AR，Limp-Foster M，Kelley MR.Going APE over ref-1［J］.Mutat Res，2000，461(2):83