微波輔助提取瑞香狼毒總黃酮工藝條件的優化*

龔 磊，黃小容，龔其海，許 潔，頡江敏 ，李玲如

1)遵義醫學院附屬醫院藥劑科遵義563003 2)遵義醫學院藥理學教研室遵義563003 3)遵義醫學院預防醫學教研室遵義563003 4)遵義醫學院藥學院 遵義563003 5)遵義醫學院藥物制劑2008 屆畢業生 遵義563003

#通訊作者，男，1944年5月生，教授，研究方向:藥物化學和天然產物化學，E-mail:jiejiangmin@vip.sohu.com

瑞香狼毒(stellera chamaejasme L.)為瑞香科狼毒屬植物，又名紅狼毒、棉大戟、斷腸草等，具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和抗結核的作用等。瑞香狼毒總黃酮是從瑞香狼毒中提取的一種重要組分，具有抗腫瘤作用［］。近年來，微波技術在天然植物的有效成分提取中得到了廣泛應用，具有設備簡單、節省時間、投資少、適用范圍廣、提取效率高、重現性好、節省試劑且污染小等優點［2-3］。作者應用微波輔助提取瑞香狼毒總黃酮，采用正交實驗設計的方法分別對料液比、溶劑濃度、微波功率及提取時間4 個因素進行考察，以期得到微波輔助提取最佳工藝條件，為進一步深入開發和利用瑞香狼毒提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 藥材、試劑及儀器 瑞香狼毒由蘭州市藥材供應站提供，經河南省南陽市藥監所黃海歐副教授鑒定為瑞香科植物瑞香狼毒(stellera chamaejasme L.);槲皮素標準品為上海化學試劑公司產品;體積分數95%乙醇、甲醇等均為分析純。JA1003N 型電子天平(上海精密科學儀器有限公司)，XH-100A 電腦微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發展有限公司)，UV-2550 型紫外-可見分光光度計(日本島津公司)。

1.2 瑞香狼毒總黃酮微波輔助提取方法的建立

1.2.1 瑞香狼毒樣品液的制備 稱取5.000 g 瑞香狼毒原料，經體積分數95%乙醇微波輔助提取后，揮發溶劑得浸膏，經甲醇溶解，定容到50 mL 容量瓶中，取0.2 mL 溶液稀釋到25 mL，取2 mL 稀釋液加甲醇定容到10 mL 即得瑞香狼毒樣品液。原料在微波輻射前均需用相應提取溶劑預浸泡2 h，使溶劑充分浸透原料，利于吸收微波輻射。

1.2.2 總黃酮含量的測定 以槲皮素標準品為對照品，采用紫外-可見分光光度法進行測定。精密稱取110℃干燥恒重的對照品2.002 mg，用甲醇定容于50 mL 容量瓶中，取0.2 mL 溶液到25 mL 容量瓶，加甲醇稀釋，定容，得質量濃度為0.32 mg/L 的標準溶液。精密量取上述標準溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分別置于10 mL 容量瓶，定容，依次在298 nm 波長處測定吸光度。以吸光度(A)對質量濃度(C)作直線回歸，回歸方程為A=0.098 56 C+0.090 04(r=0.999 6)，以此方程測算樣品液總黃酮含量。

1.3 實驗條件的優選

1.3.1 單因素實驗條件 選擇對瑞香狼毒總黃酮得率有影響的4 個因素，即料液比(A)、乙醇濃度(B)、微波功率(C)和提取時間(D)進行單因素實驗。①設定乙醇濃度(體積分數90%)、微波功率(800 W)、提取時間(60 s)，選擇5 種料液體積比(1:10、1:15、1:20、1:25、1:30)。②設定料液比(1:20)、微波功率(800 W)、提取時間(60 s)，分別選擇體積分數為50%、60%、70%、80%和90%的乙醇作為溶劑。③設定乙醇濃度(體積分數90%)、料液比(1:20)、提取時間(60 s)，選擇5 種不同微波功率(500、600、700、800 和900 W)。④設定乙醇濃度(體積分數90%)、料液比(1:20)、微波功率(800 W)，選擇5 種提取時間(30、60、90、120 和150 s)。在上述條件下按1.2 法進行瑞香狼毒總黃酮的提取，計算總黃酮得率。

1.3.2 正交實驗設計 根據單因素實驗結果，選擇上述4 個因素的較優水平，按L9(34)設計進行正交實驗。

2 結果

2.1 單因素實驗結果

2.1.1 料液比對總黃酮得率的影響 在選定其他3 個因素水平的條件下，以不同料液比進行實驗，總黃酮得率見表1。

表1 不同料液比條件下總黃酮得率(n=3)

2.1.2 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 在選定其他3 個因素水平的條件下，以不同體積分數的乙醇作為溶劑，總黃酮得率見表2。

表2 不同乙醇濃度條件下總黃酮的得率(n=3)

2.1.3 微波功率對總黃酮得率的影響 在選定其他3 個因素水平的條件下，以不同微波功率進行提取，總黃酮得率見表3。

2.1.4 提取時間對總黃酮得率的影響 在選定其他3 個因素水平的條件下，以不同提取時間進行提取，總黃酮得率見表4。

2.2 正交實驗結果 正交實驗因素水平表見表5，結果見表6和7。可以看出，對瑞香狼毒總黃酮得率的影響大小依次為:乙醇濃度(B)＞微波功率(C)＞料液比(A)＞提取時間(D)。微波萃取的優化工藝條件是B3C3A2D3，即乙醇體積分數為90%，提取時間60 s，料液比1:25，微波功率900 W。按此工藝條件下進行了3 次驗證實驗，總黃酮得率分別為33.232，33.157 和33.163 mg/g，平均33.184 mg/g。

表3 不同微波功率條件下總黃酮得率(n=3)

表4 不同提取時間條件下總黃酮得率(n=3)

表5 L9(34)正交實驗的因素水平

表6 L9(34)正交實驗結果

表7 正交實驗方差分析表

3 討論

微波輔助提取技術較傳統提取技術具有提取效率高的明顯優點［4］。在瑞香狼毒中，黃酮類成分含量較高，黃酮類化合物熱穩定性較好，極性較大，適宜于微波輔助萃取技術。

該研究以總黃酮得率為考察指標，探討了溶劑乙醇濃度、料液比、微波功率和提取時間對瑞香狼毒總黃酮提取結果的影響。結果顯示，上述4 個因素對總黃酮得率均有很大影響。因為溶劑極性隨乙醇濃度的增大而減小，極性大的溶劑吸收了大部分微波能，而藥材沒有足夠的微波能吸收，所以隨著溶劑極性的增加，總黃酮的得率反而減小。當料液比小于1:25時，隨著料液比的增大，總黃酮得率不斷增大，其原因是:提取液體積越大，溶劑與浸提物的接觸越充分，在相同時間內能溶解出更多的黃酮類化合物，使得率增大［5］。當料液比大于1:25 時，得率變化并不顯著，說明黃酮類化合物溶解基本飽和。當微波功率設定在500～800 W時，隨著功率的增大，得率增大，原因主要是:天然黃酮的萃取溫度由黃酮的熱敏性決定，微波功率和萃取溫度成正相關，在萃取時間固定時，萃取溫度隨著微波功率的增大而升高，細胞壁裂解率增高，細胞內吸收微波能的極性分子易溶出。在800～900 W 時，隨著微波功率的增大，總黃酮得率逐漸下降，這是因為溫度過高引起蛋白等不耐熱的成分糊化，造成黃酮類成分的黏附，從而導致得率降低。作者還觀察到，得率隨提取時間的延長而明顯增大，當提取時間大于60 s 時，得率明顯下降。

在單因素實驗基礎上，作者采用正交實驗確定了微波輔助提取瑞香狼毒總黃酮的最佳工藝條件。實驗結果表明，最佳工藝條件為料液比1:25，乙醇體積分數90%，微波功率900 W，提取時間60 s。在此條件下總黃酮平均得率為33.184 mg/g，該方法簡單、易行，且快速、節能，值得推廣應用。

［1］王敏，賈正平，馬駿，等.瑞香狼毒總黃酮提取物的抗腫瘤作用［J］.中國中藥雜志，2005，30(8):603

［2］馮年平，范廣平，韓朝陽.中藥提取技術研究進展［J］.中國中醫藥信息雜志，2000，7 (10):15

［3］元英進，劉明言，董岸杰.中藥現代化生產關鍵技術［M］.北京:化學工業出版社，2002

［4］張衛強，鄧宇.微波輻射技術在天然物活性成分萃取中的應用［J］.化學工業與工程技術，2001，22(6):1

［5］王志剛，秦明堅，郝利君，等.超聲波提取菝葜中總黃酮的正交實驗研究［J］.中國野生植物資源，2009，28(5):54