櫟屬7種植物種子的發(fā)芽抑制物質(zhì)研究

李慶梅，劉 艷，，劉廣全 ，劉 勇，侯龍魚，胡金鑫

(1.林木遺傳育種國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)研究所，北京 100091;2.北京林業(yè)大學(xué)森林培育與保護(hù)教育部重點(diǎn)試驗(yàn)室，北京 100083;3.中國水利水電科學(xué)研究院，北京 100048;4.西北農(nóng)林科技大學(xué)，楊凌 712100;5.中國科學(xué)院植物研究所植被與環(huán)境變化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093)

櫟屬(Quercus)是我國重要的硬闊葉樹種，具有耐寒、耐旱和耐瘠薄的生態(tài)特性［1］。麻櫟(Q.acutissima Carruth.)、銳齒櫟(Q.aliena var.acuteserrata Maxim ex Wenz.)、栓皮櫟(Q.variabilis BI.)和蒙古櫟(Q.mongolica Fischer ex ledebour.)等，在土壤改良，植被恢復(fù)、水土保持、水源涵養(yǎng)等方面具有重要作用［2］。近年來，隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，櫟屬植物已成為主要的經(jīng)濟(jì)和能源樹種，生物量和蓄積量在林木中占較大的比重［3］。

櫟類植物人工造林生產(chǎn)實(shí)踐中通常采用播種育苗，但存在延遲萌發(fā)、出苗不整齊的現(xiàn)象［4］。自然條件下，最先出苗和后出苗的相差可達(dá)數(shù)周［5］，出苗整齊性很差［6］。近幾年櫟類植物經(jīng)常采用容器育苗［7］，這就要求苗木快速整齊的萌發(fā)，這也是提高育苗質(zhì)量的一個(gè)有效途徑［8］。因此，研究和認(rèn)識(shí)造成櫟類種子延遲萌發(fā)和出苗不整齊的原因并找出相應(yīng)的改善途徑，不僅可提高育苗的質(zhì)量，改善櫟林自然更新率低的現(xiàn)狀，對育苗具有一定的指導(dǎo)意義。

櫟類種子延遲萌發(fā)和出苗不整齊的原因主要包括:(1)形態(tài)影響即種子大小和種皮機(jī)械束縛影響［4，9］;(2)次生代謝物如單寧酸和酚類等通過抑制一些代謝途徑影響種子的萌發(fā)［10］;(3)植物激素脫落酸(ABA)和植物生長調(diào)節(jié)劑(IAA)影響種子的代謝途徑［11-12］。發(fā)芽抑制物質(zhì)是由植物體產(chǎn)生的，或是植物體中雖不存在而與發(fā)芽抑制有關(guān)的物質(zhì)，這類物質(zhì)可延遲或抑制同種或異種種子的發(fā)芽［13］。Peterson［6］發(fā)現(xiàn)成熟水櫟果皮的水提物中含有抑制物質(zhì)。為了抵御昆蟲取食，櫟類種子能產(chǎn)生抑制種子萌發(fā)的次生代謝物，如多酚(polyphenols)［10］和單寧酸(tannins)［14］。但對將櫟類種子解剖成不同部位，并采用科學(xué)有效的方法提取其抑制物質(zhì)的研究較少。系統(tǒng)溶劑法和生物測定法是測定和分析種子中抑制物質(zhì)的有效方法［15-17］，且該方法在櫟類種子抑制物質(zhì)研究上應(yīng)用較少，本研究通過對7種櫟屬植物種子萌發(fā)抑制物質(zhì)的研究，試圖找出導(dǎo)致櫟屬種子延遲萌發(fā)和出苗不整齊的原因，為生產(chǎn)上采取措施提高種子發(fā)芽率和整齊性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用種子來源于中國科學(xué)院北京植物園、河南省小秦嶺自然保護(hù)區(qū)和陜西省秦嶺東段新開嶺自然保護(hù)區(qū)，各地區(qū)所采物種和氣象因子見表1。

表1 采種地點(diǎn)及相應(yīng)氣象因子Table 1 Seed sites and corresponding meteorological factors

生物活性測定所用白菜(Brassica pekinensis)種子品種為中白81，由北京中蔬園藝良種研究開發(fā)中心提供，純度96%，凈度98%，發(fā)芽率85%以上，含水量約7%。采收于2010年6月，保存在(3±1)℃的冰箱中。

1.2 研究方法

1.2.1 種子預(yù)處理和基本形態(tài)指標(biāo)測定

采收后的種子用自來水浸泡，5 min后淘汰仍漂浮在水面的種子［18］，剩下的種子(將殼斗即果碗和種子分開)擦拭干表面水分后平鋪?zhàn)匀魂幐桑g隔2—3 h翻動(dòng)1次，2 d后將種子置于(3±1)℃貯藏柜中保存。

1.2.2 種子發(fā)芽試驗(yàn)

為了驗(yàn)證櫟屬植物種子延遲萌發(fā)的現(xiàn)象，隨機(jī)選取麻櫟、夏櫟和房山櫟各45粒，15粒1組，共3個(gè)重復(fù)。將種子放入鋪有3層濾紙的培養(yǎng)皿中［4，19］置于25℃、光照8 h培養(yǎng)箱進(jìn)行發(fā)芽試驗(yàn)。種子萌發(fā)后每7 d統(tǒng)計(jì)1次，分別統(tǒng)計(jì)出根數(shù)和出芽數(shù)，并計(jì)算出根率和發(fā)芽率，計(jì)算公式如下:

出根率(%)=出根種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率(%)=發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100%

1.2.3 櫟屬7種植物種子不同部位甲醇浸提液的提取及生物活性測定

將7種種子解剖為種皮(胚和子葉外圍的部分)、種胚(胚及周圍部分子葉)和子葉(遠(yuǎn)離胚端2/3子葉)3個(gè)部分，30℃烘干后用粉碎機(jī)磨碎，過1 mm篩。分別稱取50 g加入足量的80%甲醇溶液，于(3±1)℃條件下密閉浸提，并間隔4 h攪拌1次，使其充分浸提［16］。每24 h更換1次浸提液，重復(fù)浸提3次。合并浸提液，離心，取上清液，減壓濃縮至1 g/mL。分別取一定體積濃縮液稀釋至0.5 g/mL，每個(gè)濃度10 mL，貯于(3±1)℃條件下備用。

在直徑9 cm的培養(yǎng)皿中鋪入濾紙，分別加入3 mL待測液，待各相有機(jī)溶劑完全揮發(fā)(水相除外)后，每皿內(nèi)再加入3 mL蒸餾水，并以同體積蒸餾水作為對照。白菜種子用始溫45℃水浸泡10 min后，取100粒均勻擺放在培養(yǎng)皿中，置于25℃恒溫光照培養(yǎng)箱內(nèi)，48 h統(tǒng)計(jì)白菜種子的發(fā)芽率(胚根長度大于白菜種子直徑時(shí)即為發(fā)芽)，72 h測其苗高和根長。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

圖1 種皮、子葉和胚中抑制物質(zhì)提取流程圖Fig.1 The flow chart of inhibitor extract in pericarp，cotyledon and embryo

圖2 麻櫟、夏櫟和房山櫟種子萌發(fā)過程Fig.2 The process of germinating of Q.acutissima，Q.robur and Q.×fangshanensis seeds

1.2.4 櫟屬7種植物種種子不同部位中抑制物質(zhì)的初步分離及生物活性測定

按系統(tǒng)溶劑法［15］，將種皮、子葉和種胚的甲醇浸提液分離為石油醚相、乙醚相、乙酸乙酯相、甲醇相和水相(圖3)。然后將各有機(jī)相溶液分別置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-52AA上進(jìn)行濃縮蒸發(fā)，最后將各有機(jī)相定容至1 g/mL，置于(3±1)℃冰箱中保存?zhèn)溆谩８鞣蛛x相生物活性測定方法同1.2.3。

圖3 不同濃度種子甲醇浸提液對白菜種子發(fā)芽率的影響Fig.3 Effects of different concentrations of methanol extract from embryo，cotyledon and pericarp of seeds on the germination percentage of B.pekinensis seeds

1.3 數(shù)據(jù)分析

用SPSS11.5進(jìn)行單因素方差分析，種子發(fā)芽率方差分析前經(jīng)反正弦轉(zhuǎn)換，用Schefffe檢驗(yàn)其差異顯著性。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean value±SD)表示。圖由SigmaPlot 10.0輔助完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 櫟屬3種種子萌發(fā)過程

麻櫟、夏櫟(Q.robur L)和房山櫟(Q.×fangshanensis Liou)從最初出根到出根末期分別用了14、28和28 d，最后的出根率分別為(13.3±3.8)%、(20.0±6.7)%和(24.4±3.8)%。夏櫟和房山櫟種子開始發(fā)芽的天數(shù)比出根的時(shí)間大約推遲了14 d，且發(fā)芽率均小于出根率，分別為(11.1±3.8)%、(15.6±3.8)%。麻櫟種子在培養(yǎng)期內(nèi)沒有發(fā)芽(圖2)。3個(gè)物種的生活力(TTC染色法測定)均超過80%，但出根率和發(fā)芽率均不超過30%，說明3種櫟屬種子存在延遲萌發(fā)、只生根不萌芽、出苗不整齊等現(xiàn)象。

2.2 不同濃度的種子甲醇浸提液對白菜種子發(fā)芽的影響

7種櫟屬種子的種皮、種胚和子葉甲醇浸提液對白菜種子發(fā)芽率表現(xiàn)出不同影響(圖3)。栓皮櫟、銳齒櫟、蒙古櫟、沼生櫟(Q.palustris Muench)和麻櫟種胚浸提液1.0 g/mL濃度顯著降低了白菜種子發(fā)芽率，比對照發(fā)芽率分別降低了83%、26%、26.3%、18.3%和17%;夏櫟和房山櫟分別降低了9.33%和10%，與對照沒有顯著差異。只有栓皮櫟的0.5 g/mL濃度的種胚浸提液顯著降低了白菜種子的發(fā)芽率，其它物種雖有不同程度的降低，但與對照差異不顯著(圖3)。

對于子葉甲醇浸提液，1.0 g/mL濃度時(shí)栓皮櫟、銳齒櫟和蒙古櫟以及0.5 g/mL濃度時(shí)栓皮櫟顯著降低了白菜種子發(fā)芽率，其它均沒有顯著影響(圖3)。

種皮的甲醇浸提液，只有栓皮櫟和蒙古櫟1.0 g/mL濃度顯著降低了白菜種子發(fā)芽率(圖3)。

因此，7個(gè)物種中，栓皮櫟各部分甲醇浸提液抑制作用最強(qiáng)，其次是銳齒櫟和蒙古櫟，夏櫟和房山櫟的抑制作用最弱。種子不同部位，抑制作用表現(xiàn)為胚＞子葉＞種皮，且濃度提高抑制作用增強(qiáng)。

2.3 不同濃度種子甲醇浸提液對白菜種子萌發(fā)后形成的幼苗苗高和根長的影響

圖4 不同濃度的供試種子不同部位甲醇浸提液對白菜種子苗高和根長的影響Fig.4 Effects of different concentrations of methanol extract from embryo，cotyledonand pericarp of Quercus seeds on the shoot and root length of B.pekinensis seeds

由圖4可以看出，與對照相比，1.0 g/mL和0.5 g/mL濃度7樹種種胚甲醇浸提液均顯著降低了白菜種子的苗高和根長，且高濃度的抑制作用大于低濃度。栓皮櫟、銳齒櫟、蒙古櫟和沼生櫟1.0 g/mL濃度種胚甲醇浸提液對白菜種子苗高的抑制作用顯著高于麻櫟、夏櫟和房山櫟;栓皮櫟和銳齒櫟0.5 g/mL濃度種胚甲醇浸提液白菜種子苗高顯著低于其它樹種，抑制作用較強(qiáng);各樹種間2種濃度種胚甲醇浸提液對白菜種子根長沒有顯著性差異，栓皮櫟和銳齒櫟的相對較小。

與對照相比，7個(gè)樹種的子葉甲醇浸提液均降低了白菜種子的苗高和根長。栓皮櫟和銳齒櫟子葉甲醇浸提液白菜種子的苗高最低，說明它們對苗高的抑制作用最強(qiáng)，蒙古櫟對白菜種子苗高的抑制作用最弱，其他樹種的抑制作用無顯著差異。各樹種間對根長的抑制作用差不多。高濃度的苗高和根長比低濃度的低，具有較強(qiáng)的抑制作用(圖4)。

圖4結(jié)果表明，銳齒櫟種皮兩個(gè)設(shè)定濃度的甲醇浸提液均顯著降低白菜種子的苗高，栓皮櫟、麻櫟、夏櫟、沼生櫟和蒙古櫟種皮兩個(gè)設(shè)定濃度的甲醇浸提液一定程度上降低了白菜種子苗高，且高濃度的抑制作用強(qiáng)于低濃度;房山櫟2種濃度白菜種子的苗高與對照差不多。栓皮櫟和銳齒櫟2種濃度顯著降低了白菜種子的根長，其它樹種的甲醇浸提液也一定程度抑制了白菜種子根長的生長。

7個(gè)樹種的種胚、子葉和種皮的甲醇浸提液對苗高的影響差異不大，胚和子葉的甲醇浸提液對根長的抑制作用大于種皮。

2.3 各有機(jī)相對白菜種子萌發(fā)的影響

各樹種甲醇相對白菜種子的發(fā)芽率抑制作用較強(qiáng)(圖5)，栓皮櫟、銳齒櫟和夏櫟種胚以及蒙古櫟子葉的的甲醇相均顯著降低了白菜種子的發(fā)芽率，分別降低了25.0%、17.3%、18.3%和15.3%。其它4個(gè)有機(jī)相，只有沼生櫟種皮的乙醚相對白菜種子發(fā)芽率有顯著抑制作用。

各樹種甲醇相對白菜種子苗高和根長也有顯著抑制作用，種皮對苗高沒有顯著影響。只有栓皮櫟胚的甲醇相對苗高的抑制作用明顯高于子葉，其余樹種胚和子葉甲醇相對苗高和根長的影響差異不顯著。

銳齒櫟種胚的乙酸乙酯相對苗高有顯著抑制作用，其他樹種不同部位沒有顯著抑制白菜種子苗高的生長。銳齒櫟、麻櫟和夏櫟種子3個(gè)部位以及栓皮櫟、蒙古櫟和房山櫟種胚和子葉的乙酸乙酯相均不同程度降低了白菜種子的根長，但與對照差異不顯著，因此，種胚與子葉各有機(jī)相對白菜種子根長的抑制作用大于種皮。各樹種的石油醚相、乙醚相和水相對白菜種子的苗高和根長基本沒有影響。

綜合發(fā)芽率、苗高和根長指標(biāo)看，各樹種甲醇相的抑制作用最強(qiáng)，其次是乙酸乙酯相，而且種胚和子葉的抑制作用較種皮強(qiáng)，其他相的抑制作用不是很明顯。

3 結(jié)論與討論

栓皮櫟、銳齒櫟、蒙古櫟、沼生櫟和麻櫟甲醇浸提液均能顯著降低白菜種子發(fā)芽率，且抑制作用逐漸降低，說明它們的甲醇浸提液均含有萌發(fā)抑制物質(zhì)。Peterson［6］在水櫟(Quercus nigra)果皮的水提物中也發(fā)現(xiàn)含有抑制物質(zhì)，燕山紅栗(Castanea mollissima B I cv.‘Yanshanhong’)和板栗(C.mollissima Blume)種皮中也含有抑制物質(zhì)［20-21］。有研究認(rèn)為為了抵御昆蟲取食，櫟類種子產(chǎn)生次生代謝物［9］，如多酚(polyphenols)［10］和單寧酸(tannins)［14］，這些物質(zhì)能抑制種子的萌發(fā)。對多種櫟類的統(tǒng)計(jì)表明休眠的紅櫟類(Red oaks)種子單寧酸含量明顯多于無休眠的白櫟類(White oaks)種子［22］。

夏櫟和房山櫟甲醇浸提液對白菜種子發(fā)芽率沒有顯著影響，但對根長和苗高有一定的抑制作用。Bonner and Vozzo［4］研究指出白櫟亞屬的大部分種子沒有休眠，但在萌發(fā)過程中，出苗不整齊。由此可見，櫟類種子的延遲萌發(fā)和出苗不整齊受多種物質(zhì)的影響，在物種間存在著差異。

圖5 種子各部位各有機(jī)相浸提液對白菜種子萌發(fā)的影響Fig.5 Effects of inhibitors of pericarp，embryo and cotyledon from 5 phases on the germination percentage，root length and shoot height of B.pekinensis

櫟屬7個(gè)種的種子不同部位甲醇相均能顯著降低白菜種子發(fā)芽率、苗高或根長，說明甲醇相的抑制作用最強(qiáng)，其次是乙酸乙酯相，其他相的抑制作用不是很明顯，由此推斷櫟屬種子中所含抑制物種可能為極性化合物。其它林木物種種子不同部位，如西洋參(Panax quinque folium L.)果肉［15］、珙桐(Davidia involucrata Baill.)果皮和胚乳［23］、南京椴(Tilia miquelian Maxim.)果皮和種子［24］、南方紅豆杉(Taxus ch inensis var.m airei ChengetL.K.Fu)種皮和胚乳［16］、山茱萸(Macrocarpiumofficinale Nakai)外果皮和種殼［25］和美國桂花(Osmanthus americanus)種殼和胚乳［26］的甲醇相均對白菜種子的發(fā)芽率或生長有顯著抑制作用。其中，珙桐果皮［22］、南方紅豆杉種皮和胚乳［16］和山茱萸外果皮和種殼［25］的乙酸乙酯相都含有抑制物質(zhì)。另外，西洋參果肉［15］、珙桐果皮和胚乳［23］、南京椴果皮［24］、南方紅豆杉種皮和胚乳［16］、美國桂花種殼和胚乳的乙醚相［26］以及南方紅豆杉種皮和胚乳的石油醚相和水相［16］也均含有抑制物質(zhì)。甲醇相中均含有抑制物質(zhì)可能是上述各樹種種子在貯藏和其萌發(fā)過程中的主要生理過程均相似，為了適應(yīng)環(huán)境和完成生長發(fā)育，自身會(huì)產(chǎn)生一些化合物，抑制周圍其它種子萌發(fā)或自身萌發(fā)。種子適應(yīng)不同環(huán)境條件可能是造成抑制物質(zhì)有差別的原因，如有些休眠是為了錯(cuò)開寒冷的環(huán)境，有些是為了預(yù)防干旱和驅(qū)避蟲食。種子中可能存在多種抑制物，但起關(guān)鍵作用的可能僅有一種或幾種［23］。本試驗(yàn)7種櫟屬植物種子抑制物測定均以白菜種子的萌發(fā)和生長為參照，抑制物對櫟類種子自身萌發(fā)和生長的抑制程度以及抑制機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)證明櫟類種子中含有抑制物質(zhì)，這些抑制物質(zhì)主要抑制種子萌芽和生長。研究發(fā)現(xiàn)，櫟類植物存在延遲萌發(fā)、出苗不整齊［4-5］和只生根不萌芽現(xiàn)象［27］，麻櫟、夏櫟和房山櫟種子的發(fā)芽試驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了這種現(xiàn)象。除了種皮的機(jī)械束縛［9］和子葉的影響外［7］，櫟類種子中含有抑制物質(zhì)也可能是造成其延遲萌發(fā)和出苗不整齊的原因。進(jìn)一步鑒定抑制物質(zhì)及其抑制機(jī)制，研究減弱和消除其對萌發(fā)的抑制、促進(jìn)種子的快速萌發(fā)和整齊出苗的途徑，對櫟屬植物造林生產(chǎn)和櫟類更新均具有重要意義。

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