迷迭香酸對輻射損傷小鼠造血功能的保護作用

張玉杰，李光強，徐文清 ，沈 秀，施培基

北京協和醫學院中國醫學科學院放射醫學研究所 天津市分子核醫學重點實驗室，天津300192

輻射防護劑是一類在照射前或在照射后早期使用，能夠減輕輻射對機體造成的損傷，促進損傷恢復的藥物。在電離和非電離等輻射接觸中，它扮演著重要的角色。20 世紀50 年代，輻射防護劑迎來了研究的高潮時期，70 年代以后，因為核戰威脅趨于緩和而逐漸低迷。近年來，航天航空事業飛速發展，輻射防護劑的研究又被提上日程。因此，安全、廣譜的輻射防護藥物研究不僅對醫療事業亦對航天航空事業的發展具有重要意義。

一直因強抗氧化活性而廣泛用于食品、化妝品行業的迷迭香酸，由于安全及藥效廣譜而成為醫藥領域的研究熱點。它具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、免疫調節、抗血栓和抗血小板凝聚、抗腫瘤、改善和增強認知能力及治療過敏性疾病等眾多藥理作，化學結構見圖1。最新研究發現的對抗紫外線輻射［1］和降低60Co γ 射線導致的骨髓細胞中嗜多染紅細胞微核發生率等功效［2］，引起了筆者的興趣。本研究探索迷迭香酸對亞致死劑量輻射損傷小鼠造血功能的保護作用。

圖1 迷迭香酸的化學結構Fig.1 Chemical structure of rosmarinic acid

1 材料與儀器

1.1 藥品和試劑

迷迭香酸(Rosmarinic acid，RA)購自Sigma;阿米福汀(Amifostine，WR-2721)購自大連美羅大藥廠;碳酸氫鈉、無水氯化鈣、冰醋酸、高氯酸，購自津市江天化工技術有限公司;氯化鈉注射液購自中國大冢制藥有限公司;乙二胺四乙酸二鉀(EDTA-2Ka)購自天津市光復精細化工研究所。

1.2 儀器

137Cs γ 射線照射源(Gammacel 40，加拿大);BC-2800 全自動血液細胞分析儀(邁瑞，深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司);正置熒光顯微鏡(Qlympus BX53，美國);離心機(TDZ5-WS，湘儀離心機儀器有限公司);電子精密天平(METTLER TOLEDO，美國)。

1.3 動物

健康SPF 級ICR 小鼠，由天津市實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(津)2010-0002。

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組與給藥

6～7 周齡ICR 小鼠，70 只，體重18 ± 2 g，雌雄各半，隨機分為7 組:正常組;單純照射組(IR )給予生理鹽水;陽性對照組(WR-2721)于照射前0.5 h腹腔注射WR-2721 200 mg/kg b. w.;迷迭香酸(RA)50、100、150、200 mg/kg 劑量組分別給予RANa(迷迭香酸鈉鹽)50、100、150、200 mg/kg b. w.。IR 組與RA 各劑量組均于照射前2、1 日連續口服給藥0.3 mL/只，照射當日，于照射前20 min 給藥;照射后連續給藥6 日，均每日一次。137Cs γ 射線一次性全身照射，照射劑量率71.1 rad/min，小鼠吸收劑量為5.5 Gy。實驗重復三批。

2.2 觀察指標

2.2.1 體重

取照射前2 日，照射當日，照射后2、4、6 日等5個時間點，對各組小鼠稱重，觀察體重變化。于照射后第7 日，處死之前稱取各組小鼠體重。

2.2.2 臟器系數

照射后第7 日，稱得小鼠體重，然后頸部脫椎處死。取脾臟和胸腺，稱重，按下式計算臟器系數:

2.2.3 外周血指標

照射后第7 日，小鼠摘眼球取血約1 mL，加入20 mg/mL EDTA-2Ka 的生理鹽水溶液100 μL，BC-2800 全自動血液細胞分析儀檢測白細胞(white blood cell，WBC)、血小板(blood pelet，PLT)數目及血紅蛋白(hemoglobin，HGB)濃度。

2.2. 4 股骨有核細胞數(bone marrow nucleated cells，BMNC)

于照射后第7 日，將小鼠頸部脫椎處死，取一側股骨，用白細胞稀釋液沖洗骨髓，后于熒光顯微鏡下觀察股骨有核細胞并計數。

2.2.5 脾結節(colong forming unit of spleen，CFUS)

將取出的脾臟放入Bouin 液內固定，約24 h 后，取出，用酒精沖洗去大部分黃色，肉眼計數突出脾臟表面的結節數(CFU-S)。

2.2.6 骨髓DNA 含量

照射后第7 日，小鼠頸部脫椎處死后取一側股骨，用0.005 mol/L CaCl2溶液沖洗骨髓，離心，棄上清液，加入0.2 mol/L 高氯酸溶液5 mL，充分混勻，90 ℃加熱15 min，冷卻，過濾，濾液于268 nm 處測定吸光度值(A)。DNA(μg)= 40 ×50 ×A

2.3 統計學處理

所有數據均以表示，不同實驗組間差異采用單因素ANOVA 方差分析檢驗，SPSS17.0 軟件處理，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 不同劑量RA 對γ 射線照射后小鼠體重的影響

137Cs γ 射線照射前，各組小鼠毛色及活動正常，體重增加。照射后，正常對照組因沒有受到輻射仍保持正常;IR 及RA 各劑量組均出現不同程度的梳毛光澤性下降、精神萎靡、飲食和飲水量下降;WR-2721 組的毛色及活動狀況幾與正常對照組無異。

在照射前第2 日(-2)、照射當日(0)、照射后第2(+2)、4(+4)、6(+6)日對小鼠稱重，各組小鼠體重變化趨勢見圖2。照射前，各組小鼠體重保持近相同程度的增長(P ＞0.05)，見表1。照射后，體重明顯下降，與正常對照組相比有顯著性差異(P ＜0.01);RA 100 mg/kg 組體重下降較緩和，與IR 組呈顯著差異(P ＜0.01)。WR-2721 組于照后第4日體重顯著恢復;如表1 所示，RA 各劑量組在第6日表現出不同程度的恢復，除RA 200 mg/kg 組外，其余各組均較IR 組有顯著性差異，且與WR-2721組無明顯區別(P ＞0.05)，但是RA 100 mg/kg 組恢復尤佳(P ＜0.001)。

實驗結果表明RA 能夠促進輻射損傷小鼠體重的恢復，給予小鼠迷迭香酸鈉鹽100 mg/kg 能夠很好的減輕輻射引起的體質量下降。

3.2 不同劑量RA 對受照小鼠臟器系數的影響

γ 射線照射后，小鼠脾臟和胸腺嚴重受損，WR-2721 及RA 起到了保護作用，見圖3。RA 100 mg/kg 對脾臟保護作用明顯(P ＜0.01)，與WR-2721組無顯著性差異(P = 0. 936)。RA 50、150、200 mg/kg 等劑量亦能升高脾系數，但統計學上差異無顯著性(P ＞0.05)。在對免疫器官胸腺的保護方面，給藥組明顯好于IR 組，除RA 200 mg/kg 外，其余各劑量有顯著性差異，組間差異無顯著性(P ＞0.05)，但是RA 100 mg/kg 效果最好(P ＜0.001)。從圖3、4 中可見，RA 對輻射損傷小鼠脾和胸腺的保護效果并非如預計呈劑量依賴性。

圖2 137Cs γ 射線照射前2 d(-2)至照射后第6 d(+6)小鼠體重變化趨勢Fig.2 Trends of mice's weight from the 2nd day before(-2)irradiation to the 6th day after irradiation(+6)

表1 RA 對輻射損傷小鼠體重的影響(n=30，±s)Table 1 Influence of RA on weight of mice exposed to 5.5 Gy γ-rays (n=30，±s)

表1 RA 對輻射損傷小鼠體重的影響(n=30，±s)Table 1 Influence of RA on weight of mice exposed to 5.5 Gy γ-rays (n=30，±s)

注:與單純照射組(IR)比較，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001Note:Compare with control，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001

組別Group實驗開始時小鼠體重(g)Weight of mice at the beginning of the experiment(g)照射后第6 天小鼠體重Weight of mice on the 6th day after irradiation(g)(g)正常對照組(Normal group)20.31 ±0.51 27.33 ±2.39 IR 20.67 ±1.03 19.72 ±1.54 WR－2721 20.57 ±0.85 22.02 ±1.98＊＊＊RA 50 20.68 ±1.22 21.10 ±1.27*RA 100 20.95 ±1.04 22.12 ±1.84＊＊＊RA 150 20.49 ±1.16 21.03 ±1.87*RA 200 20.85 ±1.03 20.30 ±1.30

3.3 不同劑量RA 對輻射損傷小鼠造血系統的影響

如表2 所示，5.5 Gy γ 射線照射后，小鼠造血系統嚴重受損，股骨DNA 含量、股骨有核細胞數目(BMNC)及外周血指標(WBC、HGB、PLT)明顯低于正常組，脾臟應急反應出現結節(CFU-S)。數據顯示，RA 不同劑量組均對受照小鼠造血系統有一定的保護作用。與IR 組相比，RA 能有效的升高外周血白細胞(WBC)數目，除200 mg/kg 組統計學上差異無顯著性，50(P ＜0.01)、100(P ＜0.01)、150(P＜0.05)mg/kg 均有顯著性差異。實驗給予受照小鼠RA 后，小鼠外周血載氧能力明顯提高，RA 50(P＜0.05)、100(P ＜0.01)、150(P ＜0.05)mg/kg 組血紅蛋白(HGB)含量與IR 組相比有顯著或極顯著性差異，外周血血小板(PLT)含量亦顯著升高(P ＜0.05，P ＜0.001，P ＜0.01，P ＜0.05)。

表2 不同劑量RA 對γ 射線損傷小鼠外周血相的影響(n=30，±s)Table 2 Influence of RA on the peripheral blood of γ-rays irradiated mice at different Concentrations (n=30，±s)

表2 不同劑量RA 對γ 射線損傷小鼠外周血相的影響(n=30，±s)Table 2 Influence of RA on the peripheral blood of γ-rays irradiated mice at different Concentrations (n=30，±s)

注:與IR 組比較，* P ＜0.05;＊＊ P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001Note:Compare with control，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001

組別Group WBC(×109/L)HGB(g/L)PLT(×109/L)正常對照組(Normal group)5.36 ±1.31 103.88 ±5.83 352.60 ±29.82 IR 0.78 ±0.27 91.89 ±7.68 126.71 ±32.62 WR-2721 2.16 ±0.53＊＊＊ 94.22 ±5.82 196.00 ±42.02＊＊＊RA 50 1.08 ±0.36＊＊ 96.28 ±7.69* 154.26 ±39.68*RA 100 1.11 ±0.32＊＊ 97.27 ±6.04＊＊174.00 ±43.76＊＊＊RA 150 1.06 ±0.33* 96.56 ±3.78* 165.13 ±22.14＊＊RA 200 0.86 ±0.26 94.89 ±5.77 150.63 ±39.43*

表3 不同劑量RA 對γ 射線損傷小鼠造血系統的保護作用(n=30，±s)Table 3 Protective effect of RA on the hematopoietic system of γ-rays irradiated mice at different concentrations (n=30，±s)

表3 不同劑量RA 對γ 射線損傷小鼠造血系統的保護作用(n=30，±s)Table 3 Protective effect of RA on the hematopoietic system of γ-rays irradiated mice at different concentrations (n=30，±s)

注:與IR 組比較，* P ＜0.05;＊＊ P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001Note:Compare with control，* P ＜0.05;＊＊P ＜0.01;＊＊＊P ＜0.001

組別Group DNA(μg/根股骨)BMNC(×106/根股骨)CFU-S(個/脾)正常對照組(Normal group)2804 ±290 18.97 ±3.12 0 IR 1426 ±471 9.19 ±4.27 38.71 ±19.64 WR-2721 2410 ±468＊＊＊59.94 ±14.55＊＊＊RA 50 1868 ±448＊＊20.77 ±5.48＊＊＊56.60 ±15.51＊＊RA 100 2116 ±353＊＊＊15.80 ±3.12＊＊＊63.38 ±16.69＊＊＊RA 150 2012 ±621＊＊＊17.56 ±4.30＊＊＊55.94 ±14.93＊＊RA 200 1569 ±537 15.80 ±4.92＊＊＊14.08 ±4.90＊＊55.36 ±16.01＊＊

基于RA 能夠如此明顯的促進外周血相的恢復，我們進而探討了RA 對造血系統的影響。研究顯示RA 各劑量組的股髓DNA 含量、股髓有核細胞數(BMNC)、內源性脾結節數(CFU-S)均高于IR組，但并不呈劑量依賴性。統計學處理發現，RA 各組BMNC、CFU-S 較IR 組呈顯著性差異(P ＜0.01)，而骨髓DNA 含量，與IR 比較，除200 mg/kg外，其他劑量亦有顯著性差異(P ＜0.01)。實驗結果說明，RA 50～200 mg/kg 對輻射損傷小鼠造血系統有很好的保護作用，劑量為100 mg/kg 時，效果最佳。

4 討論

電離輻射作用于機體后在瞬間以其很小的能量引發一系列物理、化學反應，進而產生一系列生物效應，表現出輻射損傷，如體重下降，免疫和造血等輻射敏感器官受損，活動能力降低等。胸腺和脾臟是重要的免疫器官，輻射導致的免疫障礙使機體處于對病原體及其他損傷因子的高敏抵抗狀態，增加了繼發感染和死亡幾率。因此胸腺和脾臟的正常與否直接關乎生命安危。脾系數和胸腺系數反映了生物體免疫功能，實驗中選取二者作為評價RA 對受照小鼠免疫系統影響的指標。造血系統對射線極具敏感性，骨髓是主要的造血組織，亦是輻射攻擊的重要目標。骨髓受到射線照射后，在分子、細胞水平上產生多方面病理變化，造成DNA 斷裂，造血干細胞急劇減少，故使外周血中白細胞、紅細胞、血小板降低。而CFU-S 和BMNC 也代表了機體造血組織恢復的能力。實驗中，通過測定小鼠外周血中WBC、PLT、HGB 及骨髓DNA 含量、BMNC、CFU-S 以研究不同劑量RA 對γ 射線照射后小鼠造血系統的影響。

因近年來，核能應用逐漸深入到人類生活的各個方面，“神九”等載人航天飛船升空，以及宇航員的太空行走和空間站的建立，人類受到射線輻射的幾率日趨升高。目前，WR-2721(氨磷汀)是國際上普遍認可的廣譜細胞保護劑，被FDA 批準與順鉑聯用治療腫瘤，但因其毒副作用嚴重而沒有被批準為輻射防護藥。研究稱其能降低行為能力［3，4］，對鈣離子代謝的影響會加重人在太空中失重引起的低血鈣［5］，還有其他如惡心、嘔吐、低血壓等一系列副作用。因此，研制高效低毒的輻射防護劑意義重大。

實驗于γ 射線照射前給小鼠連續2 d 口服不同劑量的迷迭香酸鈉鹽溶液(RA-Na)，并于照射當天照射前20 min 再口服給藥一次，5.5 Gy137Cs γ 射線一次性全身照射后，連續給藥6 d。從實驗中可以看出，相比單純照射組(IR)，迷迭香酸(RA)組小鼠體重于照射后第5 d 便開始恢復，而IR 組在第7 天仍不見上升，并且第7 d RA 組體重與IR 組有顯著性差異。體重是機體整體狀況的一個表征，迷迭香酸能夠促進受照小鼠體重恢復，初步表明其有一定的抗輻射效果。試驗進而發現，RA 50～200 mg/kg能夠防止小鼠胸腺和脾臟系數降低，有效地保護免疫器官，這與研究稱其具有免疫調節功能相映成輝［6，7］。RA 對小鼠造血系統的保護也是出乎意料，它能夠顯著升高輻射損傷小鼠外周血白細胞(WBC)、血小板(PLT)數目，提高血紅蛋白(HGB)濃度，保護骨髓組織，避免射線導致的骨髓細胞DNA 斷裂、骨髓有核細胞減少，并且促進內源性脾結節(CFU-S)形成，增強脾臟造血功能。從迷迭香酸化學結構及目前研究報道［8-10］中，我們認為試驗中迷迭香酸良好的抗輻射效果與其出眾的抗氧化能力相關。

圖5 RA 保護輻射損傷小鼠造血功能的倒“U”形劑量-效應曲線Fig.5 The inverse U-shaped dose-response curve of RA for its protective effect on hematopoietic function of radiationinjured mice

試驗中也發現，迷迭香酸100 mg/kg 防護作用最為突出，與陽性對照組效果相當，在CFU-S 指標上甚至好于陽性藥物。而且對于大多數檢測指標，迷迭香酸對輻射損傷小鼠的保護作用在50～200 mg/kg 范圍內并不成預期的劑量依賴性，而是如圖4 所示呈倒“U”字形，防護效果RA 100 ＞50 ≧150＞200 mg/kg，即在100 mg/kg 時出現最高點，之后便開始下降。此與2005 年Pereira 等在研究迷迭香酸抗焦慮作用時發現的情況相同，出現了如圖5 的倒“U”形劑量反應曲線［11，12］。我們認為這可能是由于機體不同系統對藥物劑量敏感閾值不同造成的［11］。有關迷迭香酸抗輻射作用的進一步研究仍在進行中。

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