草莓炭疽病分生孢子離體快速繁殖技術探討

忻 雅，馬華升，阮松林，王淑珍，方獻平，肖文斐

(浙江省杭州市農業科學研究院，浙江 杭州 310024)

草莓屬于薔薇科草莓屬，被譽為水果皇后，國外稱之為廉價的保健產品。中國目前草莓生產面積約7萬 hm2，居世界第1位，主要產地分布在安徽、遼寧、河北、山東、江蘇、上海、浙江等東部沿海地區，設施栽培草莓更是成為各地高效特色主導產業之一。目前南方主栽的紅頰和章姬等品種主要來自日本，不僅商品性好，口感更適合亞洲人，但其易感炭疽病的特性限制了設施草莓的可持續發展［1］。

草莓炭疽病主要爆發在夏季草莓育苗后期和初秋定植初期，主要為害匍匐莖與葉片。草莓炭疽病是由半知菌類黑盤孢目黑盤孢科刺盤孢菌屬(Colletotrichum spp．)真菌引起［2］，已經明確的致病菌主要有 3種，分別為 C．gloeosporioides、C．acutatum 和 C．fragariae［3］，我國草莓生產上以膠孢炭疽菌 (C．gloeosporioides)為多見。

目前國內對草莓炭疽病的研究主要集中在病原菌的鑒定［4-5］和防治藥劑篩選［6-8］，對于發病規律、流行條件、測報方法等報道很少。病害防治缺乏理論依據，達不到理想效果，病害逐年加重。全面、深入地了解該菌的生物學特性有助于制定和完善草莓炭疽病的防治措施。本研究通過在人工控溫、控濕條件下，研究炭疽病菌在人工條件下的產孢條件，以期明確病菌繁殖的發生規律，為病害的田間防控提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 草莓炭疽病病菌分離部位和抗生素篩選

供試草莓品種為紅頰。2011年7月，從建德、臨安等草莓育苗基地采集帶有炭疽病斑的植株，分別以有病斑的葉片、匍匐莖和根冠為材料，在病健交界處取樣。葉片樣品剪取5 mm ×5 mm左右的小塊，匍匐莖切成5 mm長、2～3 mm厚的小塊，根冠部剖開后取開始褐變的組織切成5 mm見方、2～3 mm厚的小塊。設置不同的抗生素處理:①氨芐青霉素 50 μg·mL-1+ 鏈霉素 50 μg·mL-1，②鏈霉素50 μg·mL-1，③不加抗生素。樣品用0.1%升汞進行表面滅菌，處理3 min后用滅菌水洗3次，置于光照培養箱 (MMM，德國)25℃、馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)培養基上黑暗培養。分離部位和抗生素處理形成9種組合，每種組合各接20皿，接種7 d后觀察雜菌污染率。

1.2 濕度對草莓炭疽病菌絲及分生孢子的影響

用上一步分離出的炭疽病菌邊緣菌絲塊 (3 mm×3 mm)為材料，在PDA培養基上培養，加入氨芐青霉素 50 μg·mL-1和鏈霉素 50 μg·mL-1。根據小容器空氣濕度調節法，進行適當改良，形成濕度分別為100%，90%，80%和70%的環境。光照培養箱內25℃培養，光照為1 050 lx。5 d后觀察菌落大小，10 d后用血球計數器統計分生孢子數量。

1.3 濕度和光照組合對草莓炭疽病分生孢子的影響

用上一步篩選出來的2個適宜濕度，結合不同光照處理 (Hobo電子照度溫度儀)，形成8個組合，10 d后觀察每皿分生孢子數量。

1.4 培養基和接種形態對草莓炭疽病菌絲及分生孢子的影響

選用3種培養基:PDA、PSA、酵母膏培養基;2種接種形態:生長旺盛的菌落邊緣菌絲塊 (打孔器取直徑8 mm的圓塊)、適量分生孢子團涂開成直徑8 mm的圓。組合成6種處理，在人工氣候箱內培養，溫度為25℃，濕度80%，光照為252 lx。7 d后觀察菌落大小，并刮去菌絲，10 d后統計每皿分生孢子數量。

2 結果與分析

2.1 植株部位和抗生素對草莓炭疽病菌分離效果的影響

表1所示，與不加抗生素相比，加抗生素①(氨芐青霉素 50 μg·mL-1+ 鏈霉素 50 μg·mL-1)后，污染率分別下降23.1%，54.5%和27.3%，加抗生素②(鏈霉素50 μg·mL-1)后，污染率分別下降7.7%，36.4%和9.1%。不同分離部位相比，匍匐莖在不同抗生素處理中的污染率都為最低。因此，加抗生素①、以匍匐莖為接種材料，能盡量減少草莓炭疽病菌分離時的污染率。

表1 不同分離部位和抗生素濃度下的污染率

2.2 濕度對草莓炭疽病菌絲及分生孢子生長的影響

用改良后的小容器空氣濕度調節法研究濕度對草莓炭疽病菌絲及分生孢子生長的影響，結果如表2所示，菌落直徑隨著濕度成比例增加，差異不顯著。濕度為80%時孢子量最大，70%時其次，都顯著高于另外2個濕度，100%的濕度產孢量最少。

表2 不同濕度炭疽病菌絲及分生孢子的生長情況

2.3 濕度和光照組合對草莓炭疽病分生孢子的影響

圖1顯示，除了全黑暗培養，其他光照強度下產孢量都是80%濕度高于70%，這與上面小容器空氣濕度調節法研究結果一致。其中，光照為252 lx時2種濕度下分生孢子的數量都顯著高于其他處理，其他處理間差異不顯著。

圖1 濕度和光照組合處理對草莓炭疽病分生孢子的影響

2.4 培養基及接種形態對草莓炭疽病菌絲及分生

孢子的影響

如圖2所示，從菌落直徑看，接種菌絲比接種孢子效果略好。但從分生孢子數量看，接種孢子顯著高于接種菌絲，其中PDA和PSA培養基沒有顯著差異。酵母培養基不適合用于膠孢炭疽菌的分生孢子培養。

圖2 不同培養基及接種形態對草莓炭疽病菌絲及分生孢子的影響

3 小結與討論

從本研究結果看，以匍匐莖為接種材料，培養基中加氨芐青霉素 50 μg·mL-1和鏈霉素 50 μg·mL-1，能顯著減少草莓炭疽病菌分離時的污染率。以PDA或PSA為培養基，以孢子堆為接種材料，光照為252 lx，濕度為80%，是分生孢子產生的最佳條件。

草莓根冠部直接與土壤接觸、葉片又相對容易感染其他病害，因此，病害癥狀明顯且細菌感染較少的匍匐莖是分離草莓炭疽病的較好部位。80%的濕度是產生分生孢子的最佳條件，這也是育苗后期高溫高濕條件下，炭疽病容易造成大面積死苗的原因。因此，控制子苗繁殖系數、挖除老苗，剝除老葉、殘葉等農藝措施［9］，可以盡量降低環境濕度，減少炭疽病的發生。PDA和PSA培養基對草莓炭疽病分生孢子的生長沒有顯著差異，與張海英等［4］的研究結果有較大差異。弱光培養下可以產生最大量的孢子，與張海英等［4］的研究結果較為一致，但與姚紅燕等［10］的結果略有不同。

［1］ 俞庚戍，丁峙峰，張成義，等.“紅頰”草莓苗期炭疽病藥劑防治研究 ［J］.中國南方果樹，2009，38(4):83-85.

［2］ 魏景超.真菌鑒定手冊 ［M］.上海:上?？茖W技術出版社，1979:463-475.

［3］ Porta-Puglia A，Mifsud D. Firstrecord ofColletotrichum acutatum on s trawberry in Malta ［J］. Journal of Plant Pathology，2006，88(2):228.

［4］ 張海英，張明會，劉志恒，等.草莓炭疽病病原鑒定及其生物學特性研究 ［J］.沈陽農業大學學報，2007，38(3):317-321.

［5］ 任小杰，梁艷，陸金萍，等.上海地區草莓炭疽病病原鑒定 ［J］.植物病理學報，2008，38(3):325-328.

［6］ 俞庚戍，丁峙峰，張成義，等.草莓紅頰育苗期應用多效唑防控炭疽病試驗 ［J］.浙江農業科學，2010(5):1029-1030.

［7］ 張雪，張志宏，劉月學，等.木霉菌劑提高‘紅顏’草莓炭疽病抗性的效應 ［J］.西北農業學報，2010，19(8):153-156.

［8］ 霍恒志，糜林，李金鳳，等.設施避雨育苗對紅頰草莓炭疽病的防治效果 ［J］.江西農業學報，2009，21(9):93-94.

［9］ 楊肖芳，蔣桂華，鄒宜靜.草莓炭疽病防控育苗技術［J］.上海蔬菜，2010(3):74-75.

［10］ 姚紅燕，王揚軍，周金波，等.寧波地區草莓炭疽病的病原鑒定和生物學特性 ［J］.寧波農業科技，2010(2):5-8.