藥物誘導(dǎo)后胚胎胰腺干細胞胰島素分泌研究

，，，，

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院血液學(xué)檢驗教研室，山東 青島 266071； 2 青島市市立醫(yī)院肝膽外科; 3 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院神經(jīng)外科)

糖尿病特別是Ⅰ型糖尿病嚴(yán)重威脅人類的健康，傳統(tǒng)的藥物治療方法只能暫時控制病情，并不能達到完全治愈的目的。目前胰島移植被認為是可以完全治愈糖尿病的一種方法[1]，但是其應(yīng)用受到供體不足的制約。近年來大量研究顯示，可以利用藥物體外誘導(dǎo)胚胎胰腺干細胞向胰島素分泌細胞分化。本實驗應(yīng)用藥物誘導(dǎo)人胚胎胰腺干細胞，測定誘導(dǎo)后的胰島素分泌細胞(IPCs)的胰島素分泌情況，旨在為臨床移植提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及其來源

引產(chǎn)的人胚胎(胎齡約20周)，由青島市市立醫(yī)院產(chǎn)科提供，孕婦自愿終止妊娠，胚胎的使用得到孕婦本人同意。D-Hank液、V型膠原酶、表皮生長因子(EGF)、Betacellulin、煙酰胺、雙硫腙(DTZ)、二甲基亞砜(DMSO，Sigma公司)，胎牛血清、丙酮酸鈉、β-巰基乙醇、RPMI 1640培養(yǎng)基、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)(美國Invitrogen公司)，肝細胞生長因子(HGF)、激活素A(美國R&D systems)，胰升糖素樣多肽-1(GLP-1)(美國ProSpec)，小鼠抗人巢蛋白單抗(北京中杉金橋有限公司)，人胰島素ELISA試劑盒(上海藍基生物有限公司)。

1.2 方法

1.2.1人胚胎胰腺胰島樣細胞簇的分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 參考文獻[2-3]的方法，無菌條件下取出胚胎胰腺，分離培養(yǎng)若干天后，吸出懸浮的胰島樣細胞簇(ICCs)[2]，接種到新的細胞培養(yǎng)瓶中，誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中繼續(xù)誘導(dǎo)6 d[3]。

1.2.2胚胎胰腺干細胞的鑒定 取分離出的ICCs，制備細胞爬片，使用丙酮甲醇溶液固定，室溫下放置15 min，0.1 mol/L PBS洗3 min，共3次，以體積分?jǐn)?shù)0.03的雙氧水孵育30 min。正常山羊血清封閉，37 ℃孵育30 min，加1∶100稀釋小鼠抗人巢蛋白單抗，37 ℃孵育1 h；PBS洗3 min，共3次，滴加通用型IgG抗體-HRP多聚體，37 ℃孵育15 min，PBS洗3 min，共3次；DAB溶液染色，蘇木精復(fù)染，甘油封片，顯微鏡下觀察。

1.2.3IPCs的鑒定 取DTZ 10 mg溶于10 mL的DMSO，以0.22 μm孔徑的濾膜過濾除菌待用。對誘導(dǎo)6 d后的細胞進行DTZ常規(guī)染色，每1 mL胰島制備物與10 μL的儲存液混合，37 ℃孵育10～20 min后鏡檢。

1.2.4細胞培養(yǎng)液中胰島素含量的測定 將誘導(dǎo)后DTZ染色陽性的細胞鋪于24孔板，計數(shù)板計數(shù)培養(yǎng)液中細胞密度，保證每孔的細胞密度為1×109/L左右，每隔24 h加入高濃度(25.0 mmol/L)或低濃度(5.5 mmol/L)葡萄糖溶液刺激后，吸取培養(yǎng)液上清液于EP管中，-20 ℃保存待測。連續(xù)刺激2周，測定上清液中胰島素的含量。測定方法按照人胰島素ELISA試劑盒說明書進行，酶標(biāo)儀讀板，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品濃度和吸光度(A)值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，依次讀出樣本的胰島素濃度，計算出平均值。

1.2.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行處理。所有計量資料均進行正態(tài)檢驗和方差齊性檢驗。兩組定量資料比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，P<0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組化法鑒定胚胎胰腺中胰島樣細胞簇

胚胎胰腺干細胞的細胞核和胞漿著色呈棕黃色(圖1)，為巢蛋白陽性細胞。

2.2 DTZ染色

對誘導(dǎo)6 d后的細胞與未經(jīng)誘導(dǎo)的細胞分別進行DTZ染色，誘導(dǎo)后細胞染色呈猩紅色(圖2a)，而未誘導(dǎo)細胞仍呈棕黃色(圖2b)。

2.3 ELISA法測定IPCs在葡萄糖刺激下胰島素分泌情況

誘導(dǎo)后細胞在高濃度葡萄糖(25.0 mmol/L)或低濃度葡萄糖(5.5 mmol/L)溶液刺激下胰島素分泌量分別為(137.41±6.02)和(106.40±8.61)U/L，兩者比較差異有顯著性(t=7.228,P<0.01)。

2.4 誘導(dǎo)后的IPCs 2周內(nèi)胰島素分泌情況

誘導(dǎo)后的IPCs在糖溶液刺激后，第1、3、5、7、9、11、13天的胰島素分泌量分別為(130.21±1.39)、(135.22±1.24)、(137.99±1.59)、(143.67±2.40)、(143.78±2.27)、(134.47±1.39)、(126.81±1.89)U/L。第7～9天胰島素分泌量與其他各天比較，差異有顯著意義(F=38.373,q=3.033～6.085,P<0.05)；第7天與第9天比較差異無顯著意義(P>0.05)。

3 討 論

糖尿病特別是Ⅰ型糖尿病一直是威脅人類健康的一大常見疾病，迄今尚未找到治愈的方法，嚴(yán)重影響病人的生活質(zhì)量，已成為內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病一大頑疾[4]。近年研究表明，胰島移植有望徹底治愈Ⅰ型糖尿病，然而由于供體胰腺缺乏，一直未能很好地開展該項工作。近年來研究顯示，IPCs的分化有望解決供體不足的問題。隨著干細胞生物學(xué)的發(fā)展，運用干細胞產(chǎn)生能分泌胰島素的細胞或組織的研究受到關(guān)注。大量研究已證實，應(yīng)用特定的誘導(dǎo)因子可誘導(dǎo)干細胞向所需要的細胞分化，因此胚胎胰腺干細胞也可在特定因子的誘導(dǎo)下向IPCs分化[5]。巢蛋白是細胞內(nèi)一種中間絲蛋白，最初發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)干細胞中特異性表達[6]；后來研究顯示，從人和大鼠的胰島中分離得到的巢蛋白陽性細胞體外培養(yǎng)也有很強的增殖能力，并有多向分化潛能，因此胰腺中巢蛋白陽性細胞可作為胰腺干細胞的標(biāo)志，可在體外經(jīng)誘導(dǎo)分化為IPCs[3]。正常的胰島β細胞中含有大量的鋅，而DTZ是一種鋅螯合劑[7]，能將胰島細胞染成猩紅色或棕紅色，因此，DTZ染色是鑒定胰島細胞的特異染色方法。

本研究結(jié)果顯示，高濃度葡萄糖刺激下IPCs胰島素分泌量明顯高于低濃度葡萄糖刺激，這說明誘導(dǎo)后的細胞具有胰島細胞的基本特征[8]，類似體內(nèi)胰島。雖然大量研究證明了誘導(dǎo)后細胞具有內(nèi)分泌能力，但這種能力能維持多久，每天的分泌量如何變化還未有太多報道。本實驗在胚胎胰腺干細胞誘導(dǎo)成功的基礎(chǔ)上，檢測葡萄糖溶液刺激下IPCs每天的胰島素分泌情況，觀察短期內(nèi)胰島素分泌量的變化。研究顯示，離體條件下，胚胎胰腺干細胞經(jīng)藥物誘導(dǎo)后具有胰島分泌能力，誘導(dǎo)后細胞2周內(nèi)可持續(xù)分泌胰島素，其胰島素分泌量在誘導(dǎo)后1周左右達到最大值，隨后分泌量有所降低，這一結(jié)果與利用胎兒骨髓間充質(zhì)干細胞體外誘導(dǎo)分化為IPCs的胰島素分泌情況相似[9]。具體原因尚不清楚，可能與培養(yǎng)過程中培養(yǎng)液成分和酸堿度的改變，以及細胞凋亡等情況有關(guān)。因此，誘導(dǎo)后第7～9天可作為選擇移植的最佳時期。但單純藥物誘導(dǎo)，IPCs的胰島素釋放量較正常的胰島細胞仍有很大的差異，僅為正常β細胞的1/50[10]，移植到動物或人體后這類細胞能發(fā)揮怎樣的作用，還有待于進一步研究。

圖1 巢蛋白免疫組化染色(100倍)

a：誘導(dǎo)后細胞DTZ染色呈猩紅色；b：未誘導(dǎo)細胞DTZ染色不著色。

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