竹葉柴胡炮制前后有效成分含量分析

劉偉

我國早在南北朝就有《雷公炮炙論》記錄柴胡炮制方法,中醫也認為對柴胡進行炮制后藥效會比作為原材料的生柴胡具有更高藥效。目前有使用蜂蜜、白酒、食用醋對生柴胡進行炮制的研究,也有使用鱉血制成鱉血柴胡方法。藥材發揮效果機理為其中有效成分在用藥條件下是否可以與人體相契合,但是經過炮制后柴胡有效成分是否發生變化存在一定不確定性,需要對其進行完全剖析,從而創造中藥臨床應用條件。

1 材料與方法

1.1 材料 紫外可見分光光度計選擇青島聚創環保集團有限公司生產的JC-UT2000 型號,電子天平則由上海舍巖儀器有限公司生產的電子分析天平FA 系列,由國華(常州)儀器制造有限公司生產的HDM-250 恒溫電熱套。采購由西安百川生物科技有限公司生產的柴胡皂苷a,將其作為對照樣品使用［1］。竹葉柴胡在淘寶電商平臺購買,并將其進行打粉,并過4 號篩將雜質進行篩去后保存備用。在線下超市購買蜂蜜、黃酒與食用醋。色譜醇選擇甲醇,使用實驗室純凈水,本文涉及到的磷酸、二甲氨基苯甲醛、水飽和正丁醇以及氯化鈉溶液都作為分析純使用。

1.2 方法

1.2.1 炮制柴胡工序

1.2.1.1 醋柴胡 選擇生柴胡作為原材料,將其切成適合片狀物,并以50 kg 柴胡片與6 kg 醋比例,對柴胡片充分攪拌,拌勻后使其悶潤,將食用醋徹底浸透柴胡片,再使用合適大小鍋使用文火慢炒,直到柴胡片將食用醋全部吸收干凈,表面略有干燥,將其從鍋中取出并曬干［2］。

1.2.1.2 酒柴胡 仍是取材、切片工序,以100 kg 柴胡片與10 kg 黃酒比例,依舊攪拌均勻與悶潤至透,同樣使用文火慢炒方式,取出后需要進行放涼［3］。

1.2.1.3 蜜柴胡 從超市采購的蜂蜜放進鍋中,加入開水對其進行溶解,加熱熬制,直到其沸騰后,將需要炮制的柴胡片倒入鍋中,使用文火對其進行翻炒,直到呈現深黃色,用手接觸不粘手,將其取出并放涼［4］。

1.2.2 炮制含量測量 柴胡有效成分主要分為柴胡總皂苷、揮發油以及柴胡多糖等,本文主要研究前兩種,其余暫不涉及。

1.2.2.1 柴胡總皂苷含量測量 ①溶液制備：使用電子天平稱取柴胡皂苷,加入作為色譜醇的甲醇,將其制成每1 毫升含有0.09 mg 的柴胡皂苷溶液,將其充分搖勻后獲得作為空白對照組的對照品溶液；稱取經過4 號篩篩選的柴胡粉末2 g,將其放置在帶有軟木塞的錐形瓶,并加入40 ml 含有2%氫氧化鉀的甲醇溶液,采用水浴回流方式,維持1 h,并進行二次提取,將殘渣進行過濾后將濾液全部合并在另一個含量為100 ml 的干凈量瓶,并使用甲醇將濾液進行稀釋,使溶液到達100 ml 刻度線即可［5］。取20 ml 溶液采用水浴法對液體進行徹底蒸干,并使用蒸餾水溶解殘留物,再使用已經水飽和的30 ml 正丁醇,取2 次后將正丁醇處理后溶液進行二次水浴法蒸干。將獲得殘留物使用甲醇充分溶解,轉移到50 ml 量瓶中,將其作為用于試驗的供試品溶液。②線性關系：將事先制成的對照品柴胡皂苷溶液分別取1～6 ml,共為6 組,放于帶有軟木塞的試管中,采用70℃水浴方式對溶液水分進行蒸干,利用0.2 ml 1%的二甲氨基苯甲醛將其與固體物質充分混合,溶解固體物質后繼續采用水浴方式進行加入蒸干,再次加入8 ml 磷酸,使用水浴方式持續加熱30 min后冷卻。等到溶液徹底冷卻,利用蒸餾水作為空白對照組,將其放置在545 nm 波長位置對其吸光度進行測定,將對照品的含量與其吸光度構建數學方程,可以獲得柴胡皂苷的一元線性回歸方程,設含量為M,設吸光度為A,其方程可以寫作：A=2.2822M-0.0154,r=0.9972,為保持P<0.05 這一條件,對方程計算后可以發現,可以在對照品使用含量0.09～0.54 mg 之間保持較好線性關系。③測量試驗：對生柴胡粉末精準稱取6 份,對其吸光度進行測定,從而計算生柴胡總皂苷含量［6］。在獲得生柴胡數據后取平均數,從而獲得柴胡總皂苷擁有1.5197%平均含量,相對偏差值(RSD)為1.16%,即該方法具有較好重復試驗效果。任取一類樣品溶液,分別于0 h、30 min、1 h 與2 h 時間檔次中對吸光度進行測定,其RSD 為1.82%,即配置溶液具有較好穩定性；對已測定含量的柴胡粉末稱取0.4 g,將其放置在帶有軟木塞的錐形瓶內,向瓶中加入4 ml 事先配制含量為1.51 g/L 的對照品,并向其中加入8 ml 含有2%氫氧化鉀的甲醇溶液,使用水浴法進行1 h 回流,二次提取后將殘渣過濾,再將濾液使用玻璃棒合并入另一只干凈錐形瓶中,再次使用水浴方式對溶液蒸干,使用蒸餾水將殘留物充分溶解,加入30 ml水飽和正丁醇,充分萃取,重復兩次,將正丁醇溶液進行合并,使用水浴方式將溶液充分蒸干,使用甲醇溶液將殘留物充分溶解后使用玻璃棒將其轉移至50 ml 量瓶中,對其有效成分含量進行測定,并對加入樣本的回收率采用科學方式進行計算,在6 組試驗組中,柴胡皂苷平均回收率可達100.57%,而RSD 則為1.75%。超過100%回收率,其原因是柴胡樣品中含有部分柴胡皂苷a,并在后續量入兩次柴胡皂苷a,在蒸發多余溶液后可以獲得較高回收率；使用滴管吸取供試品溶液2 ml,放置在帶有軟木塞試管內,采用水浴方式對溶液進行蒸干,檢測其殘留物的吸光度,計算竹葉柴胡的皂苷含量,可以發現作為對照組的生柴胡總皂苷為1.5197%,而使用黃酒、食用醋與蜂蜜炮制柴胡的皂苷含量分別為1.1275%、1.3175%與2.0376%。

1.2.2.2 揮發油含量測量 研究柴胡揮發油稱取10 g已過4 號篩篩選的柴胡粉末,將其放置在250 ml 容量的圓底燒瓶內,并向其中注入100 ml 15%氯化鈉溶液,使用加熱方式,保持其有1 h 的回流,回流裝置為2010 年出版的《中國藥典》改造的可以對揮發油測量的設備。在提取溶液6 h 后以25 ml 量瓶為容器,收集全部蒸餾液,并將蒸餾水注入容器中定容,充分搖勻后量取2 ml 餾出液,再加入蒸餾水進行稀釋,使其達到10 ml。另外量取2 ml 餾出液,放置于蒸發皿內,使用水浴方法將溶液蒸干,獲得殘渣再次注入蒸餾水制成10 ml 溶液,充分搖勻,將其作為試驗空白對照組［7］。利用紫外分光度法,保持277 nm 恒定波長,測定溶液吸光度。獲得經過炮制處理后柴胡的揮發油含量均超過生柴胡,而且蜜柴胡仍在試驗組中擁有最大揮發油含量。

2 結果

以竹葉柴胡為試驗材料,使用3 種炮制方法作為試驗組,生柴胡作為對照組,可以發現其有效成分柴胡皂苷a 與揮發油在炮制處理前后含量均發生相應變化,炮制后揮發油含量均超過生柴胡,而蜜柴胡含量最高,其次為酒柴胡、醋柴胡；蜜柴胡的柴胡皂苷a 含量達到2.0376%,高于生柴胡的1.5197%,而酒柴胡的柴胡皂苷a 含量為1.1275%,醋柴胡的柴胡皂苷a 含量為1.3175%,均低于生柴胡。對于柴胡成分做實驗室分析后,可以發現生柴胡使用食用醋與黃酒炮制前后出現功效差異,分析原因是竹葉柴胡內化學成分發生變化,而化學成分發生變化導致柴胡藥理作用也發生變化,這個研究方向也與中藥理論的炮制改變藥物性質目的保持一致,另一個角度對于中藥綜合整體思考與辨證討論進行驗證,體現其科學性［8］。同時,本文研究皂苷與揮發油的思路清晰明確,可以將其作為模板,套用在其他成分含量研究中也適用。還可以借助柴胡研究方法對其他中藥材同樣測定有效成分,在經過加工處理后是否出現含量變化進行研究。

3 討論

本研究試驗的蜜柴胡皂苷與揮發油的含量要明顯高于生柴胡,而黃酒與食用醋炮制后皂苷含量方面要低于生柴胡,經過炮制揮發油含量均有所上升［9］。本文提出一個設想,在柴胡進行炮制時,會因組織吸收大量熱能,造成部分組織破壞,從而讓揮發油更容易溶出,分析純則加快溶出速度,所以無論是使用黃酒、食用醋或者蜂蜜進行柴胡炮制,其揮發油含量均要高于生柴胡。揮發油會在文火炒制時溶出,但也會造成皂苷等在酸性環境下產生相應影響,更容易使其環氧醚鍵出現開環情況,進而轉變為其他成分,極有可能是黃酒與食用醋炮制柴胡皂苷含量下降原因［10-12］。同時,因為篇幅有限,所以對于炮制有效成分變化原因僅限于炮制方法,并未進一步深入研究,例如柴胡的品種差異、炮制輔料量、溫度等都需要在未來研究中進一步討論。

綜上所述,中藥成分相對復雜,使用常規手段難以徹底理清其真正作用機理。本文以竹葉柴胡為材料,對其進行炮制前后是否存在有效成分的含量變化進行探索,在一定程度上也是忽略采用不同方法進行炮制獲得制品的額外影響。雖然從數據上可以分析出蜜柴胡比柴胡炮制效果更佳,但是在實際應用時也要以臨床實踐為標準,降低中藥材在機理方面相克的負面影響。