樟子松外生菌根菌適宜培養條件的篩選

劉延濱 王承義

（黑龍江省林業科學研究所，黑龍江哈爾濱150081）

菌根這一現象在自然界中廣泛存在，保守估計大約90%以上的陸生植物具有菌根，它是植物和土壤之間能量和物質交換的通道。植物為菌根菌提供其生長發育所需的糖類物質（主要是植物光和同化產物）；菌根菌可以為植物提供水分，特別是在水分虧缺的情況下菌根菌可以為植物提供更多的水分輸送；菌根菌菌絲可以分泌大量的幾丁質酶、磷酸酶和蛋白酶等分解酶，可以直接分解有機質為植物提供N和P，也可以分解土壤中的難溶物質，甚至巖石，為植物提供各種無機營養物質，包括N、P、K及微量元素等。因而其所發揮的功能對于整個陸地生態系統至關重要，目前已經成為研究的熱點。

外生菌根菌在營養相對缺乏的森林生態系統中占絕對優勢，有許多文獻揭示出外生菌根菌可提高寄主植物無機養分的吸收。Mahmood等［1］測試了38種外生菌根，發現有些外生菌根菌的菌絲分泌草酸形成草酸鈣的晶體，P轉化成可溶性的化合物而被吸收，有學者認為這是外生菌根菌捕獲P的一種方式［2］。van Schll等［3］發現外生菌根菌菌絲可以分泌低分子有機陰離子侵蝕巖石，使云母、蛭石、硅酸鹽礦石等富K礦石釋放出K，侵蝕角閃石釋放出Mg。一般情況下，溫帶森林生態系統中土壤有機質養分占土壤養分的絕大部分，如植物枯枝落葉、動物殘體等。有研究顯示新鮮的森林腐殖質和死亡的苔蘚可以促進外生菌根菌菌絲的增殖。Bending和Read［4］研究了外生菌根菌Suillus bovinus（Fr．）O．Kuntze和Thelephora terrestris（Ehrh．）與Pinus sylvestris L．形成外生菌根后的養分捕獲行為，通過檢驗有機養分斑塊（取自發酵層有機質（fermentation horizon organic matter，FHOM））中營養成分的減少程度來度量不同外生菌根菌的塑性，結果發現前者使N、P和K濃度分別減少23%、22%和30%，后者使N和K的濃度分別減少13%和21%。

樟子松（Pinus sylvestris var．mongolica），又名海拉爾松、蒙古赤松，屬松杉綱松科松屬，是歐洲赤松分布至遠東的一個地理變種。它對土壤的要求不嚴，在干燥瘠薄、巖石裸露、沙地、陡坡，其他樹種不能生長的地方均可生長良好。因此樟子松已經成為適于干旱半干旱地區沙地抗旱造林的主要樹種之一。然而，由于樟子松外生菌根研究的嚴重缺失，未開展菌根化育苗造成苗木質量差、造林成活率低。由于干旱半干旱地區的氣候、土壤等客觀因素的影響，必須以適地適樹為基礎，配合以適當的生物技術進行抗旱造林。大量研究表明，菌根化育苗可提高造林成活率，促進苗木生長，確保該地區造林成功［5］。

因此，篩選出合適的樟子松外生菌根菌培養條件是實現樟子松菌根化育苗的基礎，本研究的目的就是通過篩選合適的培養基和合適的培養條件來使其生長迅速，為下一步的接種和大量菌種的擴繁提供依據。

1 材料與方法

1．1 實驗材料

菌種使用在豐林自然保護區分離培養的點柄粘蓋牛肝菌（Suillus granulatus（L．：Fr．）O．Kuntce）菌株。培養基使用MMN和綜合PDA培養基（表1），在培養基中加入20%樟子松葉的浸提液。

表1 培養基配方

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1．2 實驗設計

實驗室對外生菌根進行純培養，所有實驗在培養箱中進行。對分離的菌株分別使用MMN和綜合PDA培養基，在培養基中加入樟子松葉的浸提液。培養基類型，是否添加樟子松葉的浸提物共計4個水平處理，每個處理設置10個重復，共計40個實驗單位。每隔2天測定菌落的直徑作為生長狀況的測定標準。通過培養基的篩選確定較優的培養基配方進行培養條件實驗，pH值設置為6．5、7．0和7．5三個水平，溫度設置15℃和25℃兩個水平，每個水平設置10個重復，共計50個實驗單位（不考慮交互作用），同樣測定菌落直徑。

1．3 數據處理

使用spss 19．0的one－way ANOVA進行數據分析。

2 結果與分析

2．1 不同培養基對點柄粘蓋牛肝菌菌株純培養的影響

點柄粘蓋牛肝菌在綜合PDA培養基上菌絲的生長速度較在MMN培養基上快（圖1）；綜合PDA培養基中加入樟子松松針浸提液明顯能促進菌絲的生長，而樟子松松針浸提液對于MMN上的菌絲生長影響不明顯（表2）。

表2 不同培養基對菌株的生長方差分析檢驗

2．2 pH值對點柄粘蓋牛肝菌菌株純培養的影響

pH值是真菌菌絲生長的重要條件之一，因為外生菌根菌長期生長在不同的土壤中，土壤的pH值差異是很大的，比如北方的森林暗棕壤微偏酸性，鹽堿地的土壤偏堿性，外生菌根菌長期同植物進化過程中也是同不同的土壤環境相適應的。本研究主要是針對點柄粘蓋牛肝菌設置了3個不同的pH值，觀察其在不同pH值下的生長狀況，結果顯示pH值為6．5時，菌絲在綜合PDA培養基上的生長速度顯著快于pH值為7和7．5的培養基（圖2，表3）。因此，pH值為6．5綜合PDA培養基適合點柄粘蓋牛肝菌的生長。

表3 不同pH值對菌株的生長方差分析檢驗（P＜0．05）

2．3 溫度對點柄粘蓋牛肝菌菌株純培養的影響

真菌的生長同溫度是密切相關的，一般情況下存在真菌生長的適宜溫度范圍，有些真菌是低溫型的，而有些可能是高溫型的。本研究采集的點柄粘蓋牛肝菌是在伊春的豐林自然保護區，夏季溫度較低，推斷可能在較低的溫度適合其生長。但是實驗結果表明點柄粘蓋牛肝菌純培養的適宜溫度是在25℃，方差分析顯示其菌絲在溫度控制在25℃時生長迅速，在15℃時生長緩慢，差異顯著（圖3，表4）。

表4 不同pH值對菌株的生長方差分析檢驗（P＜0．05）

3 討論

培養基是外生菌根菌生長的基質，不同的外生菌根菌對于C源和N源的需求是不同的。有研究發現，以麥芽浸膏為氮源時基生菌絲比較旺盛，氮源為蛋白胨時氣生菌絲比較旺盛，因此在配置培養基時，二者以適當的比例配合使用將更利于外生菌根菌的生長。本研究中MMN培養基添加的是麥芽浸膏，而PDA培養基添加的是蛋白胨，結果表明點柄粘蓋牛肝菌適合蛋白胨作為N源。添加樟子松松針浸提液對點柄粘蓋牛肝菌生長的影響機制缺乏深入的研究，可能是某種物質促發了菌絲的快速生長，但是MMN培養基中添加與否沒有顯著影響。

溫度是影響外生菌根菌生長發育的重要因素之一，不同外生菌根菌生長的最適溫度不盡相同。一般而言，多數菌根真菌適宜在20～28℃條件下生長，最高溫度極限為35℃，但少數菌種可達40℃［6］。畢國昌等［7］對云南省不同針葉林下常見外生菌根菌的44個菌株進行純培養，發現絕大多數菌株最適生長溫度為25℃，最高臨界生長溫度為40℃，少數菌株在5℃時也能緩慢生長，長期放在5℃低溫下的菌株即使已經停止生長，一旦置于適溫條件下，均能很快恢復生長，生活力并不受影響。值得注意的是，同一菌株在人工純培養條件下與在自然條件下對溫度的要求不同。自然條件下，適宜生長溫度的范圍往往要寬一些，而且因為菌根的形成受諸多條件影響，其中還包括溫度對宿主植物的影響，所以菌根真菌菌絲體生長的最適溫度不一定是形成菌根的最適溫度［6］。

一般來說，菌根真菌喜酸性，最適pH為4．0～6．0，但是少數菌根真菌喜弱堿性生長條件［8］。謝一青等［9］、趙志鵬等［10］研究表明，不同菌株的適宜pH不盡相同，彩色豆馬勃（Pisolithus tinctor ius）、紅絨蓋牛肝（Xerocomus chrysenteron）和灰蓋牛肝菌（Boletus griseus）較適宜在酸性條件下生長，厚環乳牛肝菌（Suillus grevillei）喜中性，小美牛肝菌（Boletus speciosus）則偏堿性，劣味乳菇（Lactarius insulsus）在堿性條件下生長較好，適宜于擴大培養及推廣應用的pH在7．0～8．0，但專一性不強，相互差別也較小。本研究中，點柄粘蓋牛肝菌在微酸條件下生長較好。

試驗初步確定了點柄粘蓋牛肝菌的最適純培養條件，發現其最適生長條件為pH值6．5，溫度為25℃，加入樟子松松針浸提液的綜合PDA培養基。

［1］Mahmood，S．，Finlay R．D．，Erland，S．，Wallander，H．Solubilisation and colonisation of wood ash by ectomycorrhizal fungi isolated from a wood ash fertilised spruce forest［J］．FEMSMicrobiology Ecology，2001，35(2):151～161．

［2］Sayer J．A．and Gadd G．M．Solubilization and transformation of insoluble inorganic metal compounds to insoluble metal oxalates by Aspergillus niger［J］．Mycological Research 1997，(101):653～661．

［3］van Schll，L．，Kuyper，T．，Smits，M．，Landeweert，R．，Hoffland，E．，Breemen N．，Rock－eating mycorrhizas:their role in plant nutrition and biogeochemical cycles［J］．Plant and Soil，2008，303(1):35～47．

［4］Bending，G．D．and Read D．J．The structure and function of the vegetative mycelium of ectomycorrhizal plants V．Foraging behaviour and translocation of nutrients from exploited litter［J］．New Phytologist，1995，130(3):401～409．

［5］趙瓊，曾德慧，于占源，鄧斌，范志平．沙地樟子松人工林土壤磷素轉化的根際效應［J］．應用生態學報，2006，17（8）：1377～1381．

［6］蔣盛巖，張平，胡勁松，等．外生菌根菌白毒傘（Amanita verna）菌絲體純培養條件［J］．湖南師范大學自然科學學報，2002，25（1）：75～77．

［7］畢國昌，郭秀珍，臧穆．在純培養條件下溫度對外生菌根菌生長的影響［J］．林業科學研究，1989，2（3）：247～253．

［8］弓明欽，陳應龍，仲崇祿，等．菌根研究及應用［M］．北京：中國林業出版社，1997：37～46．

［9］謝一青，李志真，楊宗武．pH、鹽濃度及鋁離子對菌根菌生長的影響［J］．江西農業大學學報：自然科學版，2002，24（2）：204～207．

［10］趙志鵬，郭秀珍．外生菌根真菌純培養的生態學研究［J］．林業科學研究，1989，2（2）：136～141．