煙草光獨立組織培養的初步研究

摘要：本研究以煙草為試驗材料，探討了糖含量、透氣孔等因素對煙草光獨立組織培養的影響。結果表明，在無糖有氣孔的組培條件下，煙草葉片具有一定的出愈率和出芽率，煙草試管苗生長健壯、根系發達。本研究為建立煙草光獨立組織培養體系奠定了基礎。

關鍵詞：煙草；光獨立培養；無糖培養

植物光獨立組織培養，又稱無糖組織培養，是一種新型的植物組織培養技術[1]。它與傳統組織培養方法的主要區別在于[2]：①使用不含糖的培養基，以CO2作為植物的碳源，可以大幅度減少污染率；②通過控制影響試管苗生長的環境因子，促進植株光合速率，使試管苗由異養型轉變為自養型，以更接近植物自然生長狀態，生根率和成苗率顯著提高；③培養可以轉入一種較大的容器中進行，直至進行開放式、暴露式培養。

煙草是一種重要的經濟作物。煙草通過有性繁殖獲得的種苗易發生變異，而且易感病毒，造成品質退化，從而影響經濟效益。而通過組織培養技術可以獲得脫毒苗，保持煙草優良品種的性狀。本研究通過以煙草為試驗材料，探討糖含量、透氣孔等因素對植物組織培養的影響，以建立煙草光獨立組織培養體系。

1 材料與方法

1.1 材料

普通煙草（Nicotiana tabacum L.）。

1.2 培養基

（1）愈傷誘導及芽分化培養基（簡稱誘導培養基）： MS + Agar 0.8% + 2，4-D 0.5 mg/L+ 6-BA 1.0 mg/L；（2）生根培養基：MS + Agar 0.8%+ NAA 0.2 mg/L。

1.3 實驗方法

1.3.1培養條件 培養溫度25±2℃，光照14h/d，光照強度3 000lx。采用改變蔗糖含量、有無透氣孔等培養條件來研究光獨立培養技術。其中，組培瓶透氣孔的直徑為1cm。

1.3.2 愈傷組織誘導及不定芽分化 取煙草幼嫩葉片洗凈后，用70%乙醇消毒30s，0.1%升汞浸泡10min，無菌水沖洗5～6 次后，將葉片切成0.5cm×0.5cm 的小塊，接入誘導培養基中進行培養。觀察不同培養條件下外植體變化，培養2w后，記錄愈傷大小和出愈率。4w后，記錄芽誘導率（芽數/塊愈傷組織）。

1.3.3 誘導生根及移栽 取約2cm長，具有2片葉子的無根小苗（不定芽）接種于生根培養基中，2w后觀察不同培養條件下的生根率、葉片數、株高和長勢。當試管苗長至5～6cm 高時，開瓶蓋培養2d后取出，移栽到泥土盆。

2 結果與分析

2.1 無糖培養對煙草愈傷組織誘導和分化的影響

外植體葉片接入誘導培養基約2～3d 后，葉片卷曲、增厚、膨脹，2w后外植體形成疏松膨大的淺黃綠色的愈傷組織。4w后，從愈傷組織上分化出許多淺黃綠色芽點。不同培養條件對煙草愈傷組織誘導和分化的影響結果見表1。

在含糖培養條件下，無論有無透氣孔，形成的愈傷塊均較大，誘導率均達100%。4w后的芽誘導率分別為5.5、4.3。在無糖培養時，有無透氣孔對愈傷誘導影響很大，有氣孔培養的愈傷較大，誘導率較高，可達53.3%，無氣孔條件下，外植體卷曲但膨脹不明顯，出愈率只有6.7%。有氣孔的出芽率為2.8，無氣孔的出芽率為0。

表1 不同培養條件對煙草愈傷組織誘導和分化的影響

2.2 無糖培養對煙草小植株生長的影響

無根小苗接種于生根培養基后，外植體開始從其基部產生白色幼根， 葉片增多，植株長高。不同培養條件對煙草小植株生長的影響結果見表2。

由結果可知，含糖培養基中生根率達100%，葉片和株高增加明顯，長勢健壯，但根系較短。在無糖培養時，生根率有所下降，有氣孔的生根率較高，達到76.7%，無氣孔的僅為43.3%。從試驗中觀察到， 不論培養基有糖還是無糖，有氣孔培養的植株顏色鮮綠，根系較發達，無氣孔培養的植物顏色較淺，尤其是無糖無透氣孔培養的試管苗呈水漬狀，瘦弱，葉片發黃，部分死亡。

表2 不同培養條件對煙草小植株生長的影響

3 討論

光獨立培養主要是利用植株的光合作用，提高自養生長能力。由于離體培養的外植體仍然含有葉綠體，在CO2 濃度及光照適當時， 培養瓶內的小植株仍然也可以通過光合作用而自我生長[1]。但是在相對密閉的培養瓶中CO2濃度很低，通常小于空氣中的CO2濃度，這時小植株的光合作用被抑制[2]。利用透氣孔可使培養瓶中CO2濃度升高，到達空氣中的CO2濃度水平，這時就可促進小苗生長。因此有氣孔的培養條件對無糖培養非常重要。

本研究在以煙草葉片為外植體誘導愈傷組織時，發現葉片對糖的依賴性很高，含糖培養基更有利于葉片愈傷誘導和出芽，但在有氣孔的條件下，無糖培養也可以獲得一定的出愈率和出芽率。在以煙草不定芽為外植體進行試管苗培養時，無糖有氣孔培養的小植株雖然生根率略低，但試管苗顏色鮮綠，根系發達，移栽更容易存活。煙草的光獨立培養可以通過改變透氣孔、光強等培養條件而得到優化，從而使光獨立培養技術更具應用價值。

參考文獻

[1] Kozai T，Kitaya Y，Kutota C.Collected Papers on Environmental Control in Micropropagation Volume 3.Japan：Chiba University Press，1995：591-947.

[2] 楊武振，王荔，侯典云等.無糖組織培養技術研究進展[J].云南農業大學學報，2004，19（3）：239-242.

作者簡介：魯夢婷，女，浙江余姚人，中國計量學院現代科技學院本科生。

通訊作者：徐曉暉，男，浙江永康人，中國計量學院現代科技學院副教授，從事生物技術教學與研究工作。