山東桔梗多倍體誘導(dǎo)與鑒定

摘 要：在離體培養(yǎng)條件下，比較了單用不同濃度秋水仙素和0.2%秋水仙素與不同濃度二甲基亞砜（DMSO）混用對(duì)山東桔梗愈傷組織誘導(dǎo)多倍體的效果。結(jié)果表明：用0.2%秋水仙素和2% DMSO浸泡山東桔梗愈傷組織16 h，多倍體誘導(dǎo)率最高，達(dá)43.3%。桔梗多倍體植株葉顏色深、有皺褶，葉片大且厚，莖稈粗壯，節(jié)間距長(zhǎng)。經(jīng)顯微鑒定，多倍體葉氣孔增大，但單位面積氣孔數(shù)目減少。

關(guān)鍵詞：桔梗；秋水仙素；二甲基亞砜；多倍體誘導(dǎo)

中圖分類號(hào)：S567.239.035.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A 文章編號(hào)：1001-4942（2013）10-0032-03

桔梗[Platycodon grandiflorum （Jacq.）A.DC.]為桔梗科多年生草本植物，主要分布于山東、內(nèi)蒙、安徽等地，是一種藥食賞三用的極具開發(fā)利用價(jià)值的經(jīng)濟(jì)作物，為我國(guó)傳統(tǒng)大宗藥材，以干燥根入藥，具有宣肺、祛痰、排膿之功效^[1]。山東桔梗以“根直、條白、質(zhì)優(yōu)”等顯著特點(diǎn)備受韓國(guó)、日本等國(guó)外市場(chǎng)的青睞。隨著桔梗國(guó)外市場(chǎng)需求量的持續(xù)增加，作為“桔梗之鄉(xiāng)”的山東省淄博市博山區(qū)已成為全國(guó)桔梗交易的集散地。本課題組對(duì)該區(qū)域桔梗的商品性狀和品質(zhì)經(jīng)過十多年的追蹤調(diào)研發(fā)現(xiàn)，目前在生產(chǎn)中普遍存在桔梗品種缺乏、農(nóng)家種種性退化等現(xiàn)象。鑒于此，本課題組采用空間隔離去除雜化、異化植株的方法，對(duì)農(nóng)家種進(jìn)行群體改良，選育出魯梗1號(hào)和魯梗2號(hào)桔梗新品種^[2，3]。兩個(gè)品種因產(chǎn)量高、質(zhì)量?jī)?yōu)，在山東省得到較快推廣種植。

桔梗多倍體產(chǎn)量、皂甙含量都顯著高于二倍體^[4]。為此，在群體改良選育新品種的同時(shí)，對(duì)桔梗多倍體誘導(dǎo)技術(shù)進(jìn)行了探討。本試驗(yàn)采用秋水仙素添加到培養(yǎng)基和秋水仙素與二甲基亞砜（DMSO）相結(jié)合的復(fù)合誘變技術(shù)對(duì)本課題組自育品種進(jìn)行了多倍體誘導(dǎo)，旨在豐富桔梗種質(zhì)資源，為今后的品種選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

山東桔梗為自選優(yōu)良種質(zhì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的培養(yǎng) 參照陳慶亮等^[1]的培養(yǎng)方法，從田間采摘桔梗幼嫩主莖或側(cè)枝，中性洗滌液刷洗后，流動(dòng)自來水沖洗0.5 h，吸干水分，75%酒精表面滅菌30 s，無菌水沖洗5次，0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗5次，切成0.5～1 cm的小段，每段帶1個(gè)腋芽，接種于MS+0.5 mg/L BA +0.1mg/L IAA培養(yǎng)基上，25℃、16 h/d光照條件下培養(yǎng)。

1.2.2 多倍體誘導(dǎo) ①秋水仙素處理：在培養(yǎng)基MS+0.5 mg/L BA +0.1 mg/L IAA中添加秋水仙素，使其終濃度分別為0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%，愈傷組織接種于該培養(yǎng)基上誘導(dǎo)培養(yǎng)。

②秋水仙素和DMSO處理：愈傷組織用0.2%秋水仙素和濃度分別為0、1%、2%、5%的 DMSO浸泡16 h，以去離子水為對(duì)照，無菌水沖洗3次，然后接種于MS+0.5 mg/L BA +0.1 mg/L IAA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。

①和②處理，均培養(yǎng)30 d，重復(fù)3次。

1.2.3 生根培養(yǎng) 將①和②處理得到的各株系于l/2MS+0.5 mg/L IAA+0.5 mg/L PP333+0.1mg/L ABT培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根。

1.2.4 多倍體鑒定 參照王小華等^[5]的研究，利用氣孔鑒定法對(duì)多倍體幼苗進(jìn)行鑒定。 待經(jīng)①和②處理得到的試管苗長(zhǎng)出2～3輪葉片后，撕取其葉下表皮制片，用顯微鏡觀測(cè)氣孔大小及單位面積內(nèi)氣孔的數(shù)量，并拍照。

1.2.5 煉苗與移栽 煉苗：30 d后將培養(yǎng)瓶置于室外，擰松培養(yǎng)瓶蓋，3 d后瓶蓋完全擰松，但不要取下。移栽：煉苗7 d后用鑷子將幼苗從培養(yǎng)瓶中取出，輕輕去除根部瓊脂，移入蛭石和草炭土（1∶1）的營(yíng)養(yǎng)土中。移栽后7 d內(nèi)，每天噴霧2 h，保持營(yíng)養(yǎng)土水分。待植株足夠健壯時(shí)，移栽至田間。

2 結(jié)果與分析

2.1 多倍體誘導(dǎo)

由表1可知，在0～0.6%濃度范圍內(nèi)，隨著培養(yǎng)基中秋水仙素濃度增加，多倍體誘導(dǎo)率升高，成活率降低；當(dāng)秋水仙素濃度為0.6%時(shí)，多倍體誘導(dǎo)率最高，達(dá)37.5%，成活率為52.5%；當(dāng)秋水仙素濃度升高到0.8%時(shí)，多倍體誘導(dǎo)率降低到20.0%，成活率也減少為22.5%。可見，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著秋水仙素濃度的增加，多倍體誘導(dǎo)率提高，最適濃度為0.6%，大于該濃度誘導(dǎo)率降低；成活率隨著秋水仙素濃度升高而降低。

從表2可知，僅用0.2%的秋水仙素浸泡時(shí)，多倍體誘導(dǎo)率最低，為6.7%，愈傷組織存活數(shù)最高，為27個(gè)；當(dāng)用0.2%秋水仙素和2% DMSO浸泡時(shí)，多倍體誘導(dǎo)率最高，達(dá)43.3%，但愈傷組織存活數(shù)只有18個(gè)。可見，DMSO和秋水仙素共同作用提高了桔梗多倍體誘導(dǎo)率，但成活率降低。最佳誘導(dǎo)組合為0.2%秋水仙素和2% DMSO。

2.2 生根培養(yǎng)

30 d后切取生長(zhǎng)一致、2.5 cm以上的壯苗接種于生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)18 d后，底部形成7～9根乳白色的根系。表明，該培養(yǎng)基配方有利于山東桔梗試管苗生根。

2.3 多倍體鑒定

由圖1和表3可知，山東桔梗多倍體葉下表皮的氣孔平均長(zhǎng)直徑和短直徑分別為10.2 μm和6.3 μm，而二倍體分別為5.9 μm和3.5 μm；多倍體氣孔面積是二倍體的3倍多，但多倍體單位面積氣孔數(shù)減少。可見，從氣孔密度和氣孔大小上看，多倍體與二倍體均有明顯區(qū)別。

2.4 多倍體幼苗農(nóng)藝性狀

移栽14 d后，與二倍體相比，多倍體在葉片顏色、厚度、莖粗和節(jié)距等方面有明顯變化。多倍體植株葉片顏色變深，葉面出現(xiàn)明顯皺褶，葉片厚度增加，莖粗增加，節(jié)距增長(zhǎng)，生長(zhǎng)旺盛（圖2）。

3 討論

不同的外植體誘導(dǎo)多倍體，誘導(dǎo)率的高低與秋水仙素的濃度和處理方法有關(guān)系。王小華等^[5]以桔梗莖段為材料，采用秋水仙素浸泡的方法誘導(dǎo)多倍體，結(jié)果表明，以含0.1%秋水仙素處理40 h后誘導(dǎo)率最高，可達(dá)50%。鑒于愈傷組織增生速度顯著高于叢生芽增生速度，本試驗(yàn)以桔梗莖段產(chǎn)生的愈傷為材料，采用秋水仙素添加到培養(yǎng)基上的方法誘導(dǎo)多倍體，更具有實(shí)際應(yīng)用和推廣價(jià)值，結(jié)果顯示，含0.6%秋水仙素的培養(yǎng)基誘導(dǎo)率最高，可達(dá)37.5%。

關(guān)于利用秋水仙素和DMSO誘導(dǎo)多倍體變異，在其它作物研究上報(bào)道較多，但在桔梗研究上尚未見報(bào)道。王鳳寶等^[6]研究表明，0.05%秋水仙素和2%DMSO混合水溶液間歇處理甘薯種子24 h，多倍體誘導(dǎo)效果較好。張旺凡等^[7]利用2%DMSO混合不同濃度的秋水仙素處理黃精，誘導(dǎo)率低，但是變異株倍性穩(wěn)定性較好，整倍率較高。劉亞娟^[8]采用0.05%秋水仙素和2%DMSO處理百合鱗片，誘導(dǎo)率達(dá)到86%。本試驗(yàn)用0.2%的秋水仙素和2%的DMSO混合處理桔梗愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)到43.3%，且倍性穩(wěn)定性好，變異明顯。

本研究以桔梗愈傷組織為誘變材料，采用秋水仙素添加到培養(yǎng)基、秋水仙素和DMSO相結(jié)合的復(fù)合誘變技術(shù)，首次探明山東桔梗誘導(dǎo)多倍體的條件和方法，縮短了其育種進(jìn)程，獲得了桔梗多倍體育種材料，為桔梗倍性育種提供了豐富的種質(zhì)資源。

參 考 文 獻(xiàn)：

[1] 陳慶亮， 單成鋼， 朱彥威， 等. 桔梗不育系的組織培養(yǎng)和快速繁殖技術(shù)研究 [J]. 北方園藝， 2010，6：142-144.

[2] 朱彥威， 單成鋼， 倪大鵬， 等. 桔梗新品種魯梗1號(hào)的選育及栽培技術(shù) [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2009，1：115-116.

[3] 朱京斌， 陳慶亮， 單成鋼， 等. 桔梗新品種魯梗 2 號(hào)的選育及栽培技術(shù)要點(diǎn) [J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2012， 44（7）：127-128.

[4] 彭向東， 高山林， 朱丹妮. 桔梗同源四倍體株系的鑒定和桔梗皂甙D含量的比較 [J]. 藥物生物技術(shù)， 2004， 11（6）：351-355.

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[6] 王鳳寶， 付金峰， 董立峰， 等. 秋水仙素和二甲基亞砜誘變選育短蔓型甘薯新品種短蔓3號(hào) [J]. 2008， 22（2）：169-174.

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[8] 劉亞娟. 百合（Lilium spp.）離體快繁及多倍體育種研究 [D]. 重慶： 西南大學(xué)， 2009， 27-31.