斑馬魚胚胎左右不對稱發育的研究現狀與展望

摘 要：脊椎動物單從體表特征來看，一般呈兩側對稱，但是大多數內臟器官和系統在體內多為不對稱分布，而且這種分布方式對于器官或系統功能的行使是必須的。左右不對稱發育起始于胚胎時期，打破了機體兩側對稱的發育模式，在不同脊椎動物中均很保守。目前利用斑馬魚為模式生物，對胚胎左右不對稱發育的研究已經取得了一系列進展，包括臨時器官Kupffer’s 囊泡的形成、左右不對稱發育信號在側板中胚層中的傳遞、器官不對稱分布等。本文就近年來以斑馬魚為模式生物對胚胎左右不對稱發育機制研究的進展進行綜述。

關鍵詞：左右不對稱發育；Kupffer’s 囊泡；側板中胚層；細胞信號通路；正反饋調節

中圖分類號：Q959.46+8.03-1 文獻標識號：A 文章編號：1001-4942（2013）10-0135-05

脊椎動物體軸形成主要包括前后軸、背腹軸分化及之后發生的左右不對稱發育。其中左右不對稱發育打破了機體的兩側對稱發育，并且在不同脊椎動物中均很保守。脊椎動物僅從體表特征來看，一般呈兩側對稱，但是大多數內臟器官和系統在體內多為不對稱分布，而且這種分布方式對于器官或系統功能的行使是必須的。研究證實，復雜的表觀遺傳通路、信號通路、離子通路和遺傳分子機制等貫穿脊椎動物左右不對稱發育全過程。

斑馬魚（Danio rerio）屬于硬骨魚綱、短擔尼魚屬的一種硬骨魚，與其他模式動物相比，具有生長周期短、繁殖能力強、胚胎體外受精且發育迅速、早期胚胎完全透明等優點，加上日趨完善的分子、細胞、基因和胚胎操作技術，很容易實施正向和反向遺傳研究操作，使其迅速成長為最重要的模式脊椎動物之一。

在斑馬魚胚胎發育時期，左右不對稱軸的建立包括以下四個階段（圖1）。首先，從胚胎的卵裂時期（0.75 hpf， hours post fertilization）開始打破機體的對稱性發育，已經建立的前后軸和背腹軸分化方面的一些信號轉換成左右不對稱發育信號；其次，在胚胎的體節形成早期（10 hpf），逐步形成Kupffer’s 囊泡（硬骨魚中的衍生器官，類似于爪蟾中的Spemann’s 組織中心、鳥類哺乳類的Hensen’s 結），左右不對稱發育信號傳遞到胚胎的Kupffer’s 囊泡；此后，在胚胎體節形成時期（12 hpf），胚胎左右不對稱發育信號在Kupffer’s 囊泡附近或內部建立起來，然后從Kupffer’s 囊泡傳遞到胚胎的側板中胚層；最后，側板中胚層的左側和右側均具有了左右不對稱基因表達區域，不對稱發育信號傳遞到器官原基，最終調控各器官、系統在機體內呈不對稱性分布^[2]。研究證實，多條信號通路，包括Notch 信號通路^[3]、FGF信號通路^[4]、Wnt信號通路和BMP信號通路^[5]等，參與調控Kupffer’s 囊泡的形成、纖毛的形成、左右不對稱信號傳遞、內臟器官和系統不對稱性分布等，它們在胚胎發育的不同時期、不同程度的參與了左右不對稱軸形成過程，相互作用，共同整合調控早期的左右不對稱發育^[2]。而關于斑馬魚左右不對稱發育的綜述國內還未見報道，現對已有研究結果進行綜述。

1 斑馬魚胚胎左右不對稱發育的起始

斑馬魚胚胎前后軸發育起始于4-cell（1 hpf）時期。Nodal是轉錄生長因子-β家族（TGF-β）中的一員，研究證實在脊椎動物中，Nodal信號是形成左右不對稱發育軸所必須的^[3]。當胚胎發育至1 000-cell（3 hpf）時期，抑制H+/K+-ATPase 活性，將導致Nodal信號通路標志性基因southpaw及其靶基因pitx2、lefty2等在側板中胚層隨機表達，不對稱信號傳遞出現異常，最終造成器官在體內的不對稱性分布出現紊亂。由此可知，胚胎前后軸發育開始后不久，即開啟左右不對稱發育。

2 胚胎左右不對稱發育過程

2.1 左右不對稱發育器官的形成

對斑馬魚的研究發現，Kupffer’s 囊泡調控胚胎的左右不對稱發育。Kupffer’s 囊泡是暫時存在的器官，于1868年被發現^[6]。當胚胎發育到原腸期（5.7 hpf）時，背部前驅細胞（DFCs）遷移到胚胎外包最前端，在原腸期結束時（10 hpf）內卷進入胚胎內部，細胞發生形變，位置相互調整，至胚胎發育至4～6個體節（12 hpf）時，在尾芽附近靠近胚胎的腹側形成Kupffer’s 囊泡^[2，7，8]。

研究證實，胚胎卵裂時期細胞與卵黃通過胞質橋進行信息交流和物質傳遞，通常胚胎發育到64-cell（2 hpf）時期細胞與卵黃之間的胞質橋關閉，但背部前驅細胞（DFCs）與卵黃的信息交流和物質傳遞將持續到sphere（4 hpf）時期^[7]。利用這一時間差，Amack 和Yost發明了中囊胚顯微注射技術^[8]，即中囊胚時期（2.5～2.75 hpf）將帶有熒光標簽的特定morpholino反義寡核苷酸（MO，能特異封閉基因表達）注射進入卵黃（靠近細胞邊緣），這樣MO能特異進入背部前驅細胞，達到在背部前驅細胞中特異敲降基因的目的。當胚胎發育到60%外胞時期，在熒光顯微鏡下對胚胎進行挑揀，將熒光集中在背部前驅細胞的胚胎挑揀出來進入下一步實驗。通過此方法證明了Kupffer’s 囊泡由背部前驅細胞發育而來，并參與左右不對稱發育調控^[10]。切除背部前驅細胞或者Kupffer’s 囊泡，均會造成機體左右不對稱發育異常，從而證明了Kupffer’s 囊泡是建立左右不對稱軸所必須的^[10]。隨后Yost 等^[11]使用激光技術破壞胚胎背部前驅細胞以及定點敲降背部前驅細胞lrdr1基因等方法進行了更深入的研究，證明了正是短暫存在的Kupffer’s 囊泡，調控了斑馬魚胚胎早期的左右不對稱發育。

研究發現，不同脊椎動物調控左右不對稱發育的器官均是保守的。在對小鼠胚胎進行的研究中，發現了小鼠node或稱為nodal flow的相關功能。從腹側方向看，node 中的單纖毛都朝著順時針方向運動，纖毛的旋轉使得nodal flow形成了向左側的胞外流，進而產生了胚胎左右不對稱發育的信號，打破了之前胚胎中建立的兩側對稱^[12]。研究發現建立小鼠胚胎左右不對稱機制需要行使node 的功能，并且單纖毛的旋轉和液體流是建立左右不對稱軸所必須的^[13]。除node 附近細胞外，還有其他多種物質途徑參與了調控，包括與H+/K+-ATPase 活性相關的鈣離子水平、Notch 信號通路的左右不對稱激活，還有RA信號通路等，都不同程度參與了左右不對稱發育的調控^[14]。

研究證實，在除了小鼠以外的其他脊椎動物中，左右不對稱發育的信號和特征開啟出現在node 形成之前。

2.2 Kupffer’s 囊泡中單纖毛和液體流調控左右不對稱發育

斑馬魚Kupffer’s 囊泡單纖毛（典型的9+2微管結構）形成于細胞膜頂端^[10]，轉錄因子基因ift57和ift88調控單纖毛的形成并維持其形態，敲降ift57或ift88等基因，導致Kupffer’s 囊泡中單纖毛形成異常，缺乏運動能力，液體流發生紊亂，造成胚胎左右不對稱發育異常^[15]。Stubbs等^[16]研究發現，Hedgehog信號通路的靶基因——轉錄因子基因foxj1a也能主動調節運動單纖毛的產生，敲降foxj1a將下調單纖毛中lrdr1和centrin2基因的表達，最終導致Kupffer’s 囊泡液體流紊亂，干擾正常胚胎的不對稱發育。

研究表明，除了Hedgehog信號通路，其他眾多信號通路如Notch、FGF、Wnt信號通路均可調節胚胎的左右不對稱發育。Notch信號通路 deltaD （aei）突變體^[3]、或敲降FGF信號通路受體基因fgfr1a^[4]、或敲降非經典Wnt信號通路調節因子基因duboraya^[17]均會造成背部前驅細胞中形成單纖毛的組分和運輸因子減少，Kupffer’s 囊泡內單纖毛長度變短，左右不對稱發育異常。說明單纖毛的形成和維持受到Notch、FGF、Hedgehog和 nc-Wnt等信號通路的調控^{[3，4，16，17]}。

斑馬魚Kupffer’s 囊泡中的單纖毛依賴左右動力蛋白Lrdr1獲得運動能力，單纖毛旋轉形成向左側的液體流，敲降lrdr1基因不影響Kupffer’s 囊泡中單纖毛的形成，但是生成的單纖毛不具備運動能力，無法推動液體流的有序運動，從而導致southpaw等基因在側板中胚層隨機表達、內臟畸形、系統出現畸形等。說明有序的液體流對左右不對稱發育具有重要意義^[18，19]。

目前仍不清楚液體流是怎樣開啟左右不對稱發育的信號級聯，但研究發現僅在Kupffer’s 囊泡左側細胞出現高濃度Ca2+，說明Ca2+信號通路很有可能參與了此過程，有待于進一步的實驗證實。

2.3 不對稱信號從Kupffer’s 囊泡向側板中胚層的轉移

斑馬魚中Nodal信號通路的標志性基因southpaw，在胚胎發育到4～6體節時，在Kupffer’s囊泡兩側均有表達；胚胎發育至10～12體節時，其表達位置被限制在側板中胚層的左側^[21]。southpaw表達受正反饋調節方式調控，但是在側板中胚層不對稱性表達機制仍然未知^[21]。最近的研究對此提出了以下幾種可能。

單纖毛旋轉形成了向左側的液體流，促使細胞內的Ca2+集中在Kupffer’s 囊泡左側細胞內，誘導依賴Ca2+的蛋白激酶Ⅱ（CaMK-Ⅱ）磷酸化，促進內質網釋放Ca2+和胞外Ca2+向胞內轉移。Ca2+信號通路的正反饋調節可能是southpaw表達位置被限制在側板中胚層左側的原因之一^[22]。

Charon屬于Cerberus/Dan家族，也有助于southpaw在側板中胚層的不對稱性表達。胚胎發育到6體節時，charon在Kupffer’s 囊泡兩側均有表達，受到液體流的影響，當胚胎發育到8～10體節時， charon在Kupffer’s 囊泡右側表達升高，并綁定到Southpaw上，拮抗southpaw在側板中胚層右側表達。southpaw受到正反饋調節和Charon的抑制作用，使其從兩側表達轉變成僅在側板中胚層左側表達^[2，23]。

2.4 不對稱信號在側板中胚層的表達

研究發現，敲降斑馬魚Nodal 突變體中的 southpaw基因，導致其靶基因pitx2、lefty2在側板中胚層隨機表達，lefty1在胚胎中線（脊索）表達缺失或者部分缺失^[22]。這些發現表明斑馬魚存在保守基因級聯，由southpaw發起，激活Nodal信號通路，產生左右不對稱性信號，通過側板中胚層傳遞到器官原基，開啟胚胎左右不對稱發育。

Lefty1是Nodal信號通路的抑制因子。胚胎發育到10～18體節時，Southpaw和TGF-β家族中的另一成員Bmp激活胚胎中線lefty1基因表達^[24]。正常情況下Southpaw在側板中胚層左側表達，當胚胎缺少Lefty1時，Southpaw將越過胚胎中線出現在側板中胚層右側，并通過正反饋調節，刺激側板中胚層右側產生新的Southpaw蛋白，表明lefty1在胚胎中線表達時起柵欄的作用，阻止Southpaw向側板中胚層右側擴散^[25]。

在對雞胚的研究中，Tabin 等^[9]在側板中胚層左側發現了Nodal 信號的表達。在雞胚與左右不對稱發育密切相關的Hensen’s結右側，activin相關信號的激活將抑制SHH信號表達，使得SHH信號主要在Hensen’s結左側表達，從而激活左側Nodal 信號，抑制右側Nodal 信號的表達，并且與TGF-β 信號相關。TGF-β信號可以正向調控nodal在胚胎側板中胚層的表達，使其表達區域很快集在側板中胚層左側，而同時nodal的功能和表達又會受到Lefty1和Lefty2 的抑制，這樣就在側板中胚層形成了nodal表達的反饋調節通路^[2]。因此，通常通過檢測胚胎早期Nodal信號通路的標志性基因如southpaw、pitx2等的表達情況來觀察胚胎左右不對稱發育情況。

2.5 器官的不對稱分布

機體內的內臟器官和系統如大腦、心臟、肝臟、胰腺、呼吸系統、消化系統等都呈不對稱性分布。胚胎左右不對稱發育信號從側板中胚層傳遞到器官原基，調控了器官的位置分布。Southpaw在側板中胚層左側的表達信號傳遞到器官原基，確定器官生長位置^[22]。

轉基因魚[lefty1∶∶GFP]可以監測Nodal的活性，敲降轉基因魚 [lefty1∶∶GFP]的southpaw，導致間腦部位的Nodal信號在側板中胚層左側的表達量減少，表明southpaw在側板中胚層左側的表達可調控大腦Nodal信號活性。Aizawa等^[26]利用abf突變體進行研究得出，大腦與內臟器官如心臟、膽囊等在機體內的分布機制不同，abf突變體心臟會出現嚴重的畸形，約50%的胚胎心臟在機體的位置發生逆轉，在這部分胚胎中，Nodal信號僅在間腦右側被激活。

心臟的不對稱性分布受到bmp4、lefty2等基因表達的調控^[3]。胚胎發育到18～20體節時，心臟原基最早出現在側板中胚層的兩側，后遷移到中線位置融合形成管狀結構，經過一系列的環化過程，即心室向右心房向左，相互之間形成一定角度，心臟形成D-loop形狀^[27]。研究表明這個過程受到Nodal信號通路和BMP信號通路調控^[2，22]。

腸道的形成也需要經歷一系列的環化過程，依賴不對稱性信號在側板中胚層的傳遞。在野生型胚胎中，側板中胚層兩側信號在動物極和植物極的遷移是獨立進行的，腸道在機體內有序分布。敲降胚胎southpaw基因導致側板中胚層信號在動物極和植物極隨機遷移，造成腸道分布紊亂^[28]。

前人對器官在機體內的分布進行了大量研究工作，但是左右不對稱信號通過側板中胚層傳遞到器官原基的機制及最終器官位置定位機制至今仍然未知。

3 總結與展望

使用斑馬魚作為模式生物，研究脊椎動物左右不對稱軸的建立過程，發現眾多基因和信號通路參與調控Kupffer’s 囊泡的形成、左右不對稱信號在Kupffer’s 囊泡和側板中胚層之間的傳遞、器官原基的形成及器官定位等^[29]。雖然目前對斑馬魚左右不對稱發育有了一定的認識，但是仍然有許多問題沒有解決：（1）胚胎左右不對稱發育起始在前后軸、背腹軸發育之后，但是左右不對稱發育是怎樣打破兩側對稱發育的仍未清楚；（2）Kupffer’s 囊泡內液體流的有序運動可以激發不對稱發育信號級聯，但是液體流是如何接收左右不對稱發育信號并向下游傳遞的依然未知。這些問題仍需要進一步的研究。

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