鴨黃病毒熒光定量PCR檢測方法的建立

摘要：根據鴨黃病毒HBJL株NS5基因序列設計合成了引物和探針，通過對熒光定量PCR反應條件的優化，建立了TaqMan熒光定量PCR檢測鴨黃病毒的方法。結果表明，該方法具有很好的特異性和重復性，熒光定量PCR敏感性是常規PCR的100倍左右。同時對30枚人工接種的鴨胚進行檢測并與常規PCR方法進行比較，檢測結果也表明熒光定量PCR法比常規PCR的敏感性高。

關鍵詞：鴨黃病毒；TaqMan探針；熒光定量PCR

中圖分類號：S852.65+9.6 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5811-03

2010年以來，中國上海、浙江、江蘇等地出現了蛋鴨產蛋量嚴重下降及蛋鴨死亡現象。同年在湖北省一些養鴨場也出現不明原因引起的產蛋量下降現象，臨床表現為產蛋量嚴重下降甚至停止，且蛋鴨有一定的死亡率，剖檢病死鴨脾臟呈現明顯腫大，卵巢肉變，卵泡嚴重充血，出血[1]。

臨床診斷為鴨黃病毒感染引起的病毒病感染，該病的發生給養殖戶帶來了巨大的經濟損失。為了提高鴨黃病毒檢測的準確性和高效性，本研究擬建立一種能用于該病檢測的一步法熒光定量PCR方法，為鴨黃病毒的流行病學、致病機理及診斷與防治等方面提供技術平臺。

1 材料與方法

1.1 材料

鴨黃病毒HBJL株為動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室保存，該毒株用8～12日齡的鴨胚增殖。

1.2 主要試劑

TaqDNA聚合酶、AMV反轉錄酶、RNA酶抑制劑、DEPC、dNTPs、Mg2+均購自寶生物工程（大連）有限公司；Trans DNA Marker Ⅲ購于北京全式金生物科技有限公司；Viral RNA Mini Kit（50）購自上海華舜生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物和探針 根據鴨黃病毒HBJL株NS5基因序列（GenBank No. JF423123），使用Primer Primier 5軟件設計1對引物和1條探針。上游引物（DFV-F）序列為：5′-atgaataaggtggtgaaggtaatgc-3′，下游引物（DFV-R）序列為：5′-cagattcgtgaaagtgttgagagc-3′，熒光探針（DFV-P）序列為：5′-catgactgttttcccatcacgtcccgg-3′，熒光探針DFV-P 5′端標記的是熒光報告基團FAM，3′端標記的是熒光淬滅基團TAMRA。引物和探針均由上海博亞生物技術有限公司合成，TE中溶解，-20 ℃保存備用。引物DFV-F和DFV-R用于熒光定量擴增，目的片斷長130 bp。

1.3.2 標準品的制備及病毒含量的檢測 將毒株HBJL接種8～12日齡的鴨胚后，觀察5～7 d收集死亡鴨胚的胚體、尿囊膜和尿囊液，并混合研磨。凍融3次后12 000 r/min離心3次取上清即為病毒液，測定病毒含量為103.7 ELD50（0.2 mL）（Median embryo lethal dose，ELD50），將病毒原液稀釋為原來的1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6后接種8～12日齡鴨胚，每個稀釋度接種5枚鴨胚。然后將病毒上清液用Viral RNA Mini Kit提取RNA，加DEPC水溶解RNA后，-70 ℃保存作為標準品備用。

1.3.3 一步法熒光定量PCR反應條件的優化 用矩陣法對熒光定量PCR的引物濃度、探針濃度、Mg2+濃度等進行篩選優化，以得到最佳的熒光定量PCR反應條件。

熒光定量檢測的循環條件為：42 ℃ 20 min；94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，60 ℃ 50 s，50個循環。把熒光檢測的程序設定在每個循環的第二步結束時進行，檢測波長為530 nm，自動計算出Ct值并給出定量結果。

1.3.4 熒光定量PCR與常規PCR敏感性比較試驗 為了比較熒光定量PCR與常規PCR的敏感性，用10倍系列稀釋的標準品（病毒含量為103.7、102.7、101.7、100.7、10-0.3、10-1.3、10-2.3 ELD50）為定量檢測模板，用動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室自行建立的常規PCR及熒光定量PCR對檢測模板進行檢測，將PCR產物的電泳結果作為常規PCR的敏感性與熒光定量PCR檢測的敏感性進行分析比較[1]。

1.3.5 特異性試驗 為驗證本方法的特異性，同時提取禽流感、禽白血病、禽大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、新城疫、減蛋綜合征病鴨鴨胚的RNA，在相同條件下進行熒光定量PCR，觀察反應的特異性。

1.3.6 重復性試驗 取鴨黃病毒濃度為102.7、101.7、100.7 ELD50作為檢測模板，用熒光定量PCR方法進行組間重復性檢測，并對檢測結果進行統計學分析。

1.3.7 人工感染鴨胚的檢測 用鴨黃病毒HBJL株的病毒尿囊液1∶1 000稀釋后，卵黃囊接種8～12日齡鴨胚30枚，0.2 mL/只，另設接種生理鹽水為陰性對照組，連續觀察5 d后收集鴨胚，棄去24 h內死亡的鴨胚，取尿囊液及胚體胚膜，加生理鹽水研磨后，凍融3次，離心取上清液；陰性對照組的鴨胚在觀察5 d后取尿囊液及胚體胚膜，研磨后凍融3次離心取上清液。將所有待檢上清液提取RNA應用熒光定量PCR方法檢測，同時用常規PCR檢測，比較兩者檢測結果。

2 結果與分析

2.1 熒光定量PCR反應條件的優化

反應總體系20 μL，其組成為： 10倍系列稀釋的標準品或待測樣品的RNA 10 μL，10×PCR Buffer 2 μL，50 mmol/L MgCl2 1.6 μL， 25 mmol/L dNTPs 0.4 μL， 500 U/μL M-MLV酶0.2 μL ，Taq酶0.2 μL，上游引物DFV-F和下游引物DFV-R各0.8 μL，熒光探針DFV-P 為0.8 μL，去離子水補齊。

2.2 標準曲線的建立

以10倍系列稀釋的標準品（病毒含量為103.7～10-2.3 ELD50）為檢測模板，得到動力學曲線圖1和標準曲線圖2。如圖1所示，橫坐標代表循環次數，縱坐標代表熒光強度，圖中平行橫坐標的直線代表熒光閥值，曲線①～⑦分別是7個稀釋度的標準品的動力學曲線；圖2為標準品10倍稀釋進行熒光定量結果的數據經分析后自動生成的標準曲線，方程為y=-4.280 9x+33.788，R2≈0.99。從圖1可知，建立的熒光定量PCR檢測的最低病毒含量為10-0.3 ELD50，即10-4稀釋度。由圖2可知，模板濃度與Ct值之間呈良好的線性關系。

2.3 特異性及與常規PCR敏感性比較

經熒光定量PCR檢測，鴨黃病毒HBJL株均顯示出良好的擴增反應曲線，分析結果表明，擴增產物單一。與常規PCR比較，熒光定量PCR方法能檢測到10-4稀釋度的標準品，而常規PCR只能檢測到10-2稀釋度的標準品（圖3），結果表明，熒光定量PCR的敏感性是常規PCR的100倍左右。

特異性試驗中鴨黃病毒HBJL株呈典型擴增曲線，而其他禽流感、禽白血病、禽大腸桿菌、沙門氏菌、鴨疫里默氏桿菌、新城疫、減蛋綜合征均為陰性。

2.4 重復性試驗

取3份不同病毒水平的鴨黃病毒樣品進行組間重復性檢測（表1），由表1可知，重復性檢測的組間變異系數（CV）分別為4.4%、4.8%、3.7%，均小于5%，證明該檢測方法具有很好的重復性。

2.5 人工感染鴨胚的檢測

用本研究建立的熒光定量PCR方法從接種的30枚鴨胚中能檢測到鴨黃病毒。而常規PCR僅能從死亡的21枚鴨胚中檢測到陽性。結果表明熒光定量PCR的敏感性明顯高出常規PCR。

3 討論

鴨黃病毒最早于2010年在中國浙江、福建、江蘇等地種鴨、蛋鴨場大范圍流行，該病的發生引起國內禽病工作者的高度關注，曹貞貞等[2]最先對該病進行了報道，將其稱為鴨出血性卵巢炎，與此同時，騰巧泱等[3]也成功從華東地區爆發的疫情分離到該病的病原。通過一系列的研究已證實，該病原是一種與坦布蘇病毒親緣關系非常密切的黃病毒。黃病毒為黃病毒科黃病毒屬，是一種單股正鏈的RNA病毒[4]。在相關的報道中，以感染人和其他哺乳動物為主，如乙型腦炎病毒、登革熱病毒、豬瘟病毒等。但在2010年，中國首次突發大面積因該病原感染而造成的蛋鴨產蛋下降甚至死亡的疫情，給全國的養鴨業造成了極為嚴重的經濟損失，由于沒有相應的技術儲備和特異性生物制品[5]，使得疫情得不到及時地確診和控制。

針對該病原的檢測還沒有一個很好的方法，本研究建立了一步法熒光定量PCR診斷方法。熒光定量PCR方法是20世紀90年代中期發展起來的實時定量檢測特定核酸的技術，是在普通PCR的基礎上增加了一條具有高特異性的熒光標記DNA探針，通過始點定量和熒光檢測系統實時監測累積熒光強度而實現對核酸進行定量檢測的[6]。是目前國際上用在病毒檢測上最先進的檢測方法之一，綜合PCR技術、熒光標記技術、激光技術、數碼顯像技術等于一體，具有很高的檢測靈敏度[7]；靶序列由引物和探針雙重控制，特異性高，與普通PCR擴增技術相比具有無法比擬的優點。本研究針對鴨黃病毒的特異性序列進行比對分析設計了一對特異性引物和一條特異TaqMan探針，并對反應體系進行了優化，建立了一種檢測鴨黃病毒的熒光定量PCR方法，其敏感度是常規PCR的100倍左右，可對大批量可疑樣品在2 h內做出定性檢測，檢測結果直接讀出，PCR污染的機率大大降低。為鴨黃病毒致病機理、診斷防治等基礎研究提供有效的手段。

參考文獻：

[1] 張蓉蓉，溫國元，羅青平，等.一種黃病毒引起鴨產蛋下降的診斷報告[J].湖北農業科學，2011，50（19）：4010-4012，4017.

[2] 曹貞貞，張 存，黃 瑜，等.鴨出血性卵巢炎的初步研究[J].中國獸醫雜志，2010，46（12）：3-6.

[3] 騰巧泱，顏丕熙，張 旭，等.一種新的黃病毒導致蛋鴨產蛋下降及死亡[J]. 中國動物傳染病學報，2010，18（16）：1-4.

[4] FAUQUET C M. Virus taxonomy： Classification and nomenclature of viruses： eighth report of the International Committee on the Taxonomy of Viruses[M]. San Francisco： Elsevier Academic Press，2005.

[5] 趙圓圓，李傳峰，朱良強，等.鴨產蛋下降-死亡綜合征的臨床診斷與病原的初步鑒定[J].揚州大學學報（農業與生命科學版），2011，32（3）：11-14.

[6] 朱 捷，楊成君，王 君.熒光定量PCR技術及其在科研中的應用[J].生物技術通報，2009（2）：73-76.

[7] 白興華，馮 力，陳建飛，等.豬傳染性胃腸炎病毒TaqMan熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J].畜牧獸醫學報，2007，38（5）：476-481.