茅莓黃酮體外抗氧化活性研究

摘要：為了研究茅莓（Rubus parvifolius L.）不同部位（根、莖、葉）中總黃酮的體外抗氧化活性，試驗分別考察了茅莓根、莖、葉中總黃酮對羥自由基（·OH）、超氧負離子（O2-）、有機自由基（DPPH·）的清除能力及對大鼠肝組織勻漿自發性脂質過氧化反應產物丙二醛（MDA）的抑制率。結果表明，茅莓各部位黃酮在一定濃度范圍內，其清除羥自由基（·OH）、超氧負離子（O2-）、有機自由基（DPPH·）及抑制MDA的作用均呈量效關系。說明茅莓根、莖、葉中總黃酮均具有一定的體外抗氧化活性。

關鍵詞：茅莓（Rubus parvifolius L.）；總黃酮；抗氧化活性

中圖分類號：R284.2 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5828-04

茅莓（Rubus parvifolius L.）又名紅梅消、天青地白草等，系薔薇科懸鉤子屬植物茅莓（Rubus parvifolius L.）的干燥全草。本品為民間常用草藥，落葉小灌木，生于山坡、路旁荒地、灌叢和草叢中，適應性強，資源十分豐富，分布于河北、山西、陜西、四川以及中南和華東各省[1]。茅莓根、莖、葉均可作藥用，具有清熱涼血、止血、散結止痛、利尿消腫等功效[2]，其化學成分有皂苷[3，4]、黃酮[5]、酚酸類物質[6]、萜類[7]以及揮發油[8]等多種成分。研究發現茅莓根、莖、葉中均含有黃酮類物質，黃酮類化合物具有良好的抗氧化性能，具有清除人體中超氧離子自由基、抗衰老和增加機體免疫力、降血壓、降血脂、增進冠狀動脈血流量、軟化血管和防治冠心病、心絞痛及抗腫瘤等功能[8-11]。茅莓的諸多功效與其所含的黃酮類化合物有著密切的聯系，目前鮮見對茅莓不同部位總黃酮抗氧化活性的研究報道。本試驗通過對茅莓根、莖、葉總黃酮體外抗氧化活性的研究，旨在為茅莓資源進一步合理綜合利用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

茅莓采自山東煙臺昆崳山國家級自然保護區，經濱州醫學院中西醫結合學院劉孟安教授鑒定為薔薇科（Rosaceae）懸鉤子屬（Rubus L.）植物茅莓的干燥全草，參照文獻[12]中采用正交試驗優化的茅莓總黃酮提取工藝分別提取茅莓根、莖、葉中的黃酮。試驗動物為SD雄性大鼠，SPF級，體重200 g左右，由山東綠葉制藥有限公司提供。丙二醛（MDA）測試盒和總蛋白定量測試盒（BCA法）由南京建成生物工程研究所提供，批號分別為20110729、20110804；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH），純度>96%，由阿拉丁試劑公司提供；Tris堿（AMRESCO）；水（娃哈哈牌純凈水）；乙醇、石油醚（30～60 ℃）、濃鹽酸、鄰苯三酚、鄰二氮菲、雙氧水等均為國產分析純。儀器有TU-1901型雙光束紫外可見分光光度計、FA1604s型電子天平、KQ-400DB型數控超聲清洗器、PHG-9246A型電熱恒溫鼓風干燥箱、數顯恒溫水浴鍋、臺式高速冷凍離心機等。

1.2 方法

1.2.1 茅莓總黃酮的提取 分別精確稱取茅莓根、莖、葉粉末各1.0 g，參照文獻[12]進行總黃酮的提取。得到茅莓根、莖、葉總黃酮提取率分別為3.02、5.00、12.50 mg/g。

1.2.2 茅莓莖總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用[13] 空白對照管：取2.0 mL的PBS（pH 7.4，下同）溶液和4.0 mL蒸餾水于試管中，混勻。未損傷管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL鄰二氮菲（1.5 mmol/L，下同）、1.0 mL FeS04 溶液（1.5 mmol/L，下同）和2.0 mL蒸餾水于試管中，混勻。損傷管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL鄰二氮菲、1.0 mL FeS04溶液、1.0 mL蒸餾水和1.0 mL 0.02% H2O2于試管中，混勻。樣品參比管：取2.0 mL PBS溶液、1.0 mL不同濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液和3.0 mL蒸餾水于試管中，混勻。樣品管：取2.0 mL PBS、1.0 mL鄰二氮菲、1.0 mL FeSO4溶液、1.0 mL不同濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液和1.0 mL 0.02% H2O2于試管中，混勻。將上述試管置于恒溫水槽中，37 ℃保溫60 min，于波長536 nm處測吸光度（A），根據公式（1）計算茅莓莖總黃酮提取液對羥自由基（·OH）的清除率。茅莓根和葉分別按相同方法檢測。

羥自由基（·OH）清除率=[（A樣品-A樣參）-（A損傷-A空白）]/（A未損-A損傷）×100% （1）

1.2.3 茅莓莖總黃酮對超氧負離子（O2-）的清除作用[14] 采用鄰苯三酚自氧化法[15，16]。取Tris-HCl緩沖溶液（50 mmol/L，pH 8.2） 4.5 mL分別與0.4 mL不同濃度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液混勻，室溫下放置4 min，于325 nm處測定樣品吸光度（Ai）。取Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL和3.0 mL 7 mmol/L鄰苯三酚，于325 nm處每隔30 s測其吸光度（A0），共記錄3 min。依上法，取Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL分別與0.4 mL不同濃度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液混勻，在室溫下放置4 min，立即加入3.0 mL 7 mmol/L鄰苯三酚并開始計時，以10 mmol/L HCl為參比，于325 nm處每隔30 s測定其吸光度（A），共記錄5 min。根據公式（2）計算茅莓莖總黃酮提取液對超氧負離子（O2-）的清除率。茅莓根和葉分別按相同方法檢測。

超氧負離子（O2-）清除率={1-[（A-Ai）/A0]}×100%

（2）

1.2.4 茅莓莖總黃酮對有機自由基（DPPH·）的清除作用 取2.0 mL 0.2 mmol/L的DPPH溶液分別與2.0 mL不同濃度（2、4、6、8和10 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液混勻。30 min后以樣品提取溶劑（30%乙醇溶液）為空白調零，于525 nm處測定其吸光度（Ai）；同時測定2.0 mL 0.2 mmol/L DPPH溶液與2.0 mL蒸餾水混合液的吸光度（Ac）；取2.0 mL無水乙醇分別與2.0 mL不同濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液混勻，于525 nm處測定其吸光度（Aj）。根據公式（3）計算茅莓莖總黃酮提取液對有機自由基（DPPH·）的抑制率。茅莓根和葉按相同方法檢測。

有機自由基（DPPH·）抑制率=[1-（Ai-Aj）/Ac]×100%

（3）

1.2.5 茅莓莖總黃酮對大鼠肝組織勻漿自發性脂質過氧化反應產物MDA的作用[17] 處死大鼠，迅速取出其肝臟，用冷生理鹽水洗凈后擦干水分稱重，于冰水浴下用生理鹽水制成10%的肝組織勻漿懸浮液。試驗組分別取不同濃度（20、40、60、80和100 μg/mL）茅莓莖總黃酮提取液0.1 mL，置10 mL玻璃試管中，再分別加入0.1 mL 10%肝組織勻漿；對照組取0.1 mL 30%乙醇溶液與0.1 mL 10%肝組織勻漿，混合均勻封好試管口置于37 ℃恒溫水浴箱中溫育45 min。按MDA測定試劑盒說明書進行操作，分光光度計用蒸餾水調零后于532 nm處測各組的吸光度。根據公式（4）計算茅莓莖總黃酮提取液對MDA的抑制率。茅莓根和葉按相同方法檢測。

MDA的抑制率=（A對照組-A試驗組）/A對照組×100% （4）

2 結果與分析

2.1 茅莓莖總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用

由圖1可見，隨著茅莓莖總黃酮濃度的增加，其對羥自由基的清除作用也隨之增強，茅莓莖黃酮濃度為100 μg/mL時，對羥自由基（·OH）的清除率為56.8%。

2.2 茅莓莖總黃酮對超氧負離子（O2-）的清除作用

由圖2可見，隨著茅莓莖總黃酮濃度的增加，其對超氧負離子（O2-）的清除作用也隨之增強，茅莓莖總黃酮濃度為10 μg/mL時，對超氧負離子（O2-）的清除率為76.0%。

2.3 茅莓莖總黃酮對有機自由基（DPPH·）的清除作用

由圖3可見，在一定濃度范圍內，隨著茅莓莖總黃酮濃度的增加，其對有機自由基（DPPH·）的清除作用也隨之增強，茅莓莖總黃酮濃度為100 μg/mL時，對有機自由基（DPPH·）的清除率為92.0%。

2.4 茅莓莖總黃酮對大鼠肝組織勻漿自發性脂質過氧化反應產物MDA的作用

由圖4可見，在一定濃度范圍內，隨著茅莓莖總黃酮濃度的增加，其對大鼠肝組織勻漿自發性脂質過氧化產物MDA的抑制作用也隨之增強，茅莓莖總黃酮濃度為100 μg/mL時，對MDA的抑制率為47.4%。

經相同的方法分別對茅莓根和葉中總黃酮的體外抗氧化活性進行研究，與茅莓莖同體積的茅莓根和葉總黃酮濃度分別為6.0、25 μg/mL時，對超氧負離子（O2-）的清除率分別為46.1%、93.4%；茅莓根和葉總黃酮濃度分別為60、250 μg/mL時，對羥自由基（·OH）的清除率分別為41.6%、88.9%，對有機自由基（DPPH·）的清除率分別為71.0%、93.0%，對MDA的抑制率分別為46.0%、45.6%。

3 小結與討論

本試驗結果表明，茅莓根、莖、葉總黃酮均具有一定的抗氧化能力，且其黃酮類化合物的添加量在試驗范圍內與其抗氧化性呈正相關。MDA為脂質過氧化產物，其生成的多少可以反映出組織細胞的受損程度。從試驗結果可得出，茅莓中總黃酮對脂質過氧化有一定的抵抗能力，且與黃酮濃度呈量效關系。同體積的茅莓根、莖、葉黃酮提取液對羥自由基（·OH）、超氧負離子（O2-）、有機自由基（DPPH·）均具有清除能力，對大鼠肝組織勻漿自發性脂質過氧化產物MDA均有一定的抑制作用。由于茅莓葉中黃酮含量相對較高，因此其體外抗氧化活性相對較高。茅莓根、莖、葉中的黃酮對超氧負離子（O2-）和有機自由基（DPPH·）的清除能力相對較強。自由基（Free radical，FR）是外層軌道上有不成對電子的原子、原子團或分子的總稱，通常包括羥自由基（·OH）、超氧負離子自由基（O2-）、有機自由基（DPPH·）等。高濃度的自由基能夠破壞細胞成分，對機體十分危險，可使得糖類、氨基酸、蛋白質、核酸和脂類等發生氧化，遭受損傷與破壞，從而引發衰老、腦缺血、帕金森氏癥、風濕性關節炎、呼吸窘迫綜合征、心血管疾病和癌癥等疾病[18，19]。通過對羥自由基（·OH）、超氧負離子（O2-）和有機自由基（DPPH·）清除作用的研究發現，茅莓中黃酮對3種自由基均具有良好的清除作用，對3種自由基的清除作用均隨其濃度的增加而增強，呈明顯的量效關系，這種抗氧化能力來自于其酚羥基的供氫或供電子能力，從而與活性氧發生氧化還原反應。這一研究為進一步開發利用茅莓資源提供了一定的理論基礎。

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