PMA—LAMP法對克氏螯蝦樣品中沙門氏菌的快速檢測

摘要：采用環介導等溫擴增技術（PMA-LAMP）對克氏螯蝦（Cambarus Clarkii）樣品中沙門氏菌進行快速檢測，旨在建立一種快速簡便、靈敏度高、特異性強的檢驗方法。分別采用PMA-LAMP、PCR檢測方法對沙門氏菌進行檢測。結果表明，PMA-LAMP法檢測限為2×10 CFU/mL，PCR法和GB/T 4789.4-2008檢測限為2×103 CFU/mL。采集湖北省省內60份市售的克氏螯蝦樣品，分別采用PMA-LAMP檢測方法、PCR檢測方法及國家標準方法（GB/T 4789.4-2008）對樣品進行檢測，PMA-LAMP 方法檢出6例沙門氏菌，陽性率為10%；PCR檢測方法檢出4例沙門氏菌，陽性率為6.7%；國家標準方法檢出4例沙門氏菌，陽性率為6.7%。

關鍵詞：PMA-LAMP法；沙門氏菌（Salmonella）；克氏螯蝦（Cambarus Clarkii）

中圖分類號：TS207.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5854-04

湖北省是小龍蝦（克氏螯蝦，Cambarus clarkii）養殖大省，小龍蝦養殖業快速發展的同時也引發了食源性病原微生物污染的食品安全問題。2010年7月份以來，南京陸續收治因食用克氏螯蝦而入院的病人，經檢查診斷為橫紋肌溶解綜合征（哈夫病）。螯蝦體內的藥物殘留、重金屬及攜帶的病原微生物都可能成為哈夫病的致病因素。克氏螯蝦養殖主要分布于低湖田、水稻田、池塘、溝渠等地區，受生長環境的影響，克氏螯蝦體內可能寄生多種病原微生物，在養殖、運輸、銷售等諸多環節均有可能產生安全隱患，但是這些過程食品安全隱患很難被發現，只有進入餐飲環節后，安全問題才得以突顯。因此在小龍蝦養殖業中建立快速監測病原微生物的方法及制定標準化的養殖體系迫在眉睫。

沙門氏菌（salmonella）是最常見的食源性病原微生物，可引起人畜胃腸炎、傷寒和副傷寒等癥[1，2]。人畜感染后可呈無癥帶菌狀態，也可表現為有臨床癥狀的致死疾，它可加重病態或死亡率，或者降低動物的繁殖生產力。傳統的沙門氏菌檢測方法，由于其檢測周期長、程序復雜等缺點已不能滿足現代檢測要求，因此研究沙門氏菌快速、有效的檢測方法顯得尤其重要[3-5]。常規檢測采用傳統培養方法，致病菌需要獨立的檢測方法單獨進行檢測，工作量大，檢測周期長，且受到檢測人員的專業、經驗等多種因素限制，容易出現誤判[6，7]。隨著分子生物學方法在食品微生物檢測中的逐步應用，致病菌的檢測效率也逐步提升。聚合酶鏈式反應（PCR）技術不斷應用于病原微生物的快速檢測。但PCR技術在現場快速檢測適用性上具有一定的局限性。環介導等溫擴增技術（PMA-LAMP）由Nagamine等[8]于2000年建立，該技術通過針對靶基因的6個區域而設計4種特異引物，利用具有鏈置換活性的Bst DNA聚合酶，在恒溫條件下（60～65 ℃）高效擴增目標DNA。該方法具有檢測快速、特異性強、靈敏度高、操作簡便、適用于現場檢測。與PCR反應相比，PMA-LAMP反應最明顯的優勢是不需要高精密的儀器設備，同時檢測靈敏度和特異性又能滿足快速鑒定病原微生物的需要[6]。

1 材料與方法

1.1 標準菌株

鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028、大腸埃希氏菌ATCC25922、福氏志賀菌CMCC6120513、金黃色葡萄球菌CMCC26003、單核細胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、創傷弧菌ATCC27562均購自廣東省微生物研究所。

1.2 試劑及培養基

食品中沙門氏菌PMA-LAMP快速檢測試劑盒（湖北泰揚生物工程有限公司）；疊氮溴化丙錠（Biotium公司）；DNA Marker、Taq酶購于北京天根生物有限公司；二甲亞砜（Sigma公司）；緩沖蛋白胨水、亞硒酸鹽胱氨酸增菌液、四硫磺酸鹽煌綠增菌液、亞硫酸鉍瓊脂、HE瓊脂、三糖鐵瓊脂、營養肉湯和營養瓊脂均購自北京陸橋技術有限公司。

1.3 儀器

電熱恒溫水浴鍋（金壇新航儀器有限公司）；S1000型PCR擴增儀、Gel Doc EQ凝膠成像系統（Bio-Rad公司）；高速離心機（Sigma公司）；電泳儀（北京六一廠）；全自動高壓滅菌鍋（日本三洋公司）。

1.4 樣品的制備和選擇性增菌

依據 GB/T4789.4-2008《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》方法進行樣品制備和選擇性增菌。

1.4.1 國家標準方法 依據GB/T 4789.4-2008《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》進行菌株的分離和生化鑒定試驗。

1.4.2 PCR檢測方法 根據GenBank公布的沙門氏菌invA基因序列，應用Primer 5設計特異性引物。上游引物為GTGAAATTATCGCCACGTTCGGG

CAA；下游引物為TCATCGCACCGTCAAAGGAACC。

20 μL的擴增體系包括：2 μL反應液，1 μL DNA模板，上下游引物各1 μL （0.2 μmol/L），2 μL dNTP mixture，1 μL Taq酶，1 μL 25 mmol/L MgSO4，11 μL去離子水。PCR 反應體系：94 ℃預變性5 min，30個循環，每個循環94 ℃（30 s）、56 ℃（30 s）、72 ℃（30 s）， 72 ℃（10 min）。擴增產物在2 %瓊脂糖凝膠上100 V電泳分離60 min，加樣量為5 μL/上樣孔。

1.4.3 疊氮溴化丙錠處理 用20%二甲基亞砜配制40 mmol/L的PMA溶液，-20 ℃避光保存。將PMA（40 mmol/L）依次加入裝有0.5 mL沙門氏菌活菌菌懸液離心管中，充分混勻后，將離心管于暗室中放置15 min。然后將離心管開蓋放置冰上，距鹵鎢燈（500 W）約15 cm，曝光時間為5 min。

1.4.4 沙門氏菌DNA模板制備 將過夜培養的沙門氏菌菌懸液（2×109 CFU/mL）置于離心管中，依次稀釋為2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×10 CFU/mL的菌懸液，經過疊氮溴化丙錠處理后，在100 ℃沸水中煮沸5 min，8 000 r/min離心2 min，取上清液作為DNA模板備用。

1.4.5 PMA-LAMP檢測方法 根據GenBank公布的沙門氏菌invA基因序列，應用Primer Explorer 4設計特異引物。引物序列如表1所示，引物由上海生工合成。PMA-LAMP反應體系（25 μL）如下：依次加入10×Thermopol反應緩沖液2.5 μL，Bst聚合酶1 μL，引物，dNTP，模板和去離子水。引物FIP和BIP終濃度為1.8 μmol/L；引物F3和B3終濃度為0.2 μmol/L；引物LF和LB終濃度為1.0 μmol/L。在62 ℃水浴中反應60 min，在85℃水浴中溫浴5 min使酶失活。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠上120 V電泳分離60 min，加樣量為5 μL/上樣孔。

1.5 PMA-LAMP檢測方法的特異性

分別將4株沙門氏菌和其他5株非沙門氏菌（依次為大腸埃希氏菌ATCC25922、福氏志賀菌CMCC6120513、金黃色葡萄球菌CMCC26003、單核細胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、創傷弧菌ATCC27562）接種到增菌培養基上，于（36±1） ℃，300 r/min 搖床培養16 h，離心后將菌體依次用無菌生理鹽水稀釋至2×104 CFU/mL菌懸液，按照“1.4.5”的方法進行檢測。

1.6 人工污染食品中沙門氏菌檢測

1.6.1 不同濃度菌液的制備 挑取沙門氏菌標準菌株ATCC14028至營養肉湯中增菌，于（36±1） ℃，300 r/min 搖床培養16～18 h，用生理鹽水制成菌懸液，依次再用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋至2×107、2×106、2×105、2×104 CFU/mL。

1.6.2 人工污染樣的制備 將檢測無沙門氏菌污染的克氏螯蝦樣品按GB/T 4789.4-2008方法制成1∶10 稀釋液。吸取制備好的 2×106、2×105、2×104、2×103 CFU/mL菌懸液依次加入每組1∶10 稀釋液中，混勻，菌懸液濃度依次為2×105、2×104、2×103、2×102 CFU/mL，于（36±1）℃培養12～16 h后分別按照國家標準方法、PCR檢測方法及PMA-LAMP檢測方法進行檢測。

2 結果與分析

2.1 沙門氏菌PCR和PMA-LAMP檢測方法檢測結果

將鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028按照2×109、2×108、2×107、2×106、2×105、2×104、2×103、2×102、2×10 CFU/mL依次稀釋，通過煮沸法提取鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 DNA，將其用于PMA-LAMP反應和PCR反應，當反應體系中存在鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028 DNA時，PMA-LAMP檢測方法擴增反應會產生大量的、大小不等的DNA重復序列，凝膠上呈現典型的梯型電泳條帶。檢測結果如圖1所示。由圖1可知，PCR檢測鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的檢出限為2×103 CFU/mL，而PMA-LAMP檢測鼠傷寒沙門氏菌ATCC14028的檢出限為2×10 CFU/mL。

2.2 PMA-LAMP檢測方法的特異性

4株沙門氏菌均呈陽性反應，其他5株非沙門氏菌（為大腸埃希氏菌ATCC25922、福氏志賀菌CMCC6120513、金黃色葡萄球菌CMCC26003、單核細胞增生李斯特菌CMCC（B）54002-5、創傷弧菌ATCC27562均為陰性（圖2）。由圖2可知，按照方法“1.4.3”的擴增體系，62 ℃溫育45 min，4株沙門氏菌在凝膠上呈現典型的梯型電泳條帶，5株非沙門氏菌均為陰性，去離子水作為陰性對照，通過瓊脂糖凝膠電泳無擴增條帶。

2.3 人工污染克氏螯蝦樣品中沙門氏菌檢測結果

將檢測無沙門氏菌污染的克氏螯蝦樣品按GB/T 4789.4-2008方法制備樣品，菌懸液濃度依次為2×105、2×104、2×103、2×102 CFU/mL，于（36±1）℃培養18～24 h后分別按照國家標準方法、PCR檢測方法及PMA-LAMP檢測方法進行檢測（表2）。由表2可知，國家標準方法與PMA-LAMP檢測方法的檢測結果一致。PCR檢測方法的最低檢出限高于國家標準方法和PMA-LAMP檢測方法。

2.4 克氏螯蝦樣品的檢測結果

采集60份市售的克氏螯蝦樣品，PMA-LAMP 檢測方法檢出6例沙門氏菌，陽性率為10%；PCR檢測方法檢出4例沙門氏菌，陽性率為6.7%；國家標準方法檢出4例沙門氏菌，陽性率為6.7%。PMA-LAMP檢測方法與國家標準方法的陽性率差異不顯著性，并且比國家標準方法的檢出限低。

3 結論

湖北省是水產養殖大省，近年來湖北省大力發展克氏螯蝦養殖，其年平均產值達20億元以上。克氏螯蝦養殖主要集中在水稻田、池塘、溝渠等地，受養殖環境的影響，克氏螯蝦體內可能會寄生多種病原微生物，由此容易引發食源性病原微生物問題。因此在養殖環節建立食源性病原微生物監測體系，對食源性病原微生物做到早檢測早預防。目前LAMP技術已被應用于食源性病原微生物的快速檢測，與傳統的快速檢測方法相比較，PMA-LAMP檢測方法具有檢測快速、操作簡便、靈敏度高、特異性強、成本較低、不需要精密儀器的優點，特別適合現場快速檢測的需求。本研究建立了快速檢測克氏螯蝦沙門氏菌PMA-LAMP檢測技術，應用PMA-LAMP檢測方法檢測克氏螯蝦樣品中沙門氏菌，與國家標準檢測方法比對，兩種方法檢測結果相同，可為食品安全快速檢測提供一種新的思路，PMA-LAMP檢測方法具有快速、靈敏度高、操作簡便等優點，并能檢測鑒定沙門氏菌病原活細胞[6，9]。

參考文獻：

[1] JACOBSEN C S， HOLBEN W E. Quantification of mRNA in Salmonella spp. seeded soil and chicken manure using magnetic capture hybridization RT-PCR[J]. Journal of Medical Microbiology，2007，69（2）：315-321.

[2] KANEKO H， KAWANA T， FUKUSHIMA E， et， al. Tolerance of loop mediated isothermal amplification to a culture medium and biological substances[J]. Journal of Biochemical and Biophysical Methods，2007，70（3）：499-501.

[3] LI X， ZHANG S， ZHANG H， ZHANG L， et al. A loop-mediated isothermal amplification method targets the phoP gene for the detection of Salmonella in food samples[J]. International Journal of Food Microbiology，2009，133（3）：252-258.

[4] MALORNY B， BUNGE C， HELMUTH R. A real-time PCR for the detection of Salmonella Enteritidis in poultry meat and consumption eggs[J]. Journal of Medical Microbiology，2007， 70（2）：245-251.

[5] NOVINSCAK A， SURETTE C， FILION M. Quantification of Salmonella spp. in composted biosolids using a TaqMan qPCR assay[J]. Journal of Medical Microbiology， 2007，70（1）：119-126.

[6] 魯玉俠，郭祀遠，石 磊，等. PMA-LAMP方法快速檢測死/活的食源性沙門氏菌[J].食品科學，2009，30（22）：324-327.

[7] SAROJ S D， SHASHIDHAR R， KARANI. Rapid， sensitive and validated method for detection of Salmonella in food by an enrichment broth culture-nested PCR combination assay[J]. Molecular and Cellular Probes，2008，22（3）：201-206.

[8] NAGAMINE K， HASE T， NOTOMI T. Accelerated reaction by loop mediated isothermal amplification using loop primers[J]. Molecular and Cellular Probes，2002，16（3）：223-229.

[9] 張 毅，王愛華，王貴春. PMA-LAMP方法快速檢測死/活的食源性副溶血性弧菌[J].江蘇農業科學，2012，40（10）：290-292.