草莓新品種晶玉高效離體再生體系的建立

摘要：以草莓新品種晶玉為試材，研究了不同植物生長調節劑濃度和配比對其葉片、葉柄再生的影響及不同暗培養時間對葉片再生的影響，并篩選出了最佳的生根培養基，建立了晶玉的高效離體再生體系。結果表明，培養基MS+2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D對晶玉葉片不定芽的分化效果最好，平均不定芽再生率可達81.45%，每葉塊平均再生芽數達到4.47個；暗培養7 d有利于葉片不定芽的再生。培養基MS+3.0 mg/L TDZ +0.05 mg/L 2，4-D對晶玉葉柄不定芽再生的效果最好。最佳生根培養基為1/2 MS+ 0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA。

關鍵詞：草莓；晶玉；離體再生；葉片；葉柄

中圖分類號：S668.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）23-5912-05

晶玉是湖北省農業科學院經濟作物研究所以甜查理為母本，晶瑤為父本雜交選育的草莓新品種，于2012年通過湖北省農作物品種審定委員會的審定[1]。該品種具有品質較優、抗炭疽病和白粉病、豐產性好等優勢，是生產上很有潛力的一個栽培品種。建立其高效的再生體系，對于草莓品種的種質交換及進一步的遺傳轉化研究具有重要意義[2，3]。

國內外對草莓的組織培養再生研究已有一些報道，主要集中在對草莓莖尖快速繁殖，不同品種的葉片、葉柄、花藥不定芽再生等方面[4-6]。在草莓再生的相關研究中涉及的品種主要是豐香、晶瑤、Tudla、全明星、紅顏等[7-12]，但具有高效再生體系的優良草莓品種仍然較少，有必要進一步對新審定的草莓品種進行高效再生體系研究。本研究以晶玉葉片、葉柄為試材，研究了不同激素濃度和配比對葉片、葉柄不定芽分化的影響，暗處理對不定芽分化的影響等，建立了草莓新品種晶玉的高效離體再生體系。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為草莓新品種晶玉，2011年4月種植于湖北省農業科學院經濟作物研究所草莓試驗圃，6月在田間選取健壯草莓母株上，生長充實而小葉尚未展開的匍匐莖頂端約3～4 cm長的頂芽。

1.2 無菌材料的獲得

將匍匐莖頂芽用自來水沖洗干凈并擦干，轉入超凈工作臺，按下列程序消毒。70%酒精浸潤30 s，無菌水沖洗1次，然后用0.1% HgCl2消毒10 min，無菌水沖洗5次。將處理好的頂芽在無菌紙上逐層剝去幼葉取出莖尖生長點，接于MS培養基上生長，培養條件為溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d（下同）。莖尖在MS培養基上成活后，在MS+0.5 mg/L BA+0.05 mg/L NAA培養基上繼代培養1次，以25 d苗齡無菌試管苗的葉片、葉柄為試驗材料。

1.3 不同濃度6-BA與IAA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

取長勢健壯、三出復葉均展開的晶玉無菌試管苗葉片，去除葉片邊緣部分，切成5 mm×5 mm左右的小塊狀葉盤，以近軸面向下與再生培養基接觸進行培養。再生培養基以MS+30 g/L 蔗糖（Sucrose）+ 2.5 g/L 菲特膠（Phytagel）為基本培養基，pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的6-BA與0.1、0.3、0.5 mg/L 的IAA激素配比，50 d后進行觀察統計，研究不同濃度的6-BA與IAA組合對晶玉草莓葉片不定芽再生的影響。每個處理80片葉，每處理3次重復。接種后培養條件為：溫度（25±2） ℃、光照度 1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d（除暗培養外，下同）。

1.4 不同濃度TDZ與2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

同“1.3”的接種培養方法，以MS+ 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為基本培養基，pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的噻苯隆（TDZ，Thidiazuron）與0.05、0.10、0.20 mg/L 的2，4-D激素配比，50 d后進行觀察統計，研究不同濃度的TDZ與2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生的影響。

1.5 不同濃度TDZ與IBA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

同“1.3”的接種培養方法，以MS+30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為基本培養基， pH 5.8，分別添加1.0、2.0、3.0 mg/L 的TDZ與0.1、0.3、0.5 mg/L 的IBA激素配比，50 d后進行觀察統計，研究不同濃度的TDZ與IBA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響。

1.6 不同暗培養時間對晶玉葉片不定芽再生的影響

以MS + 2.0 mg/L TDZ + 0.05 mg/L 2，4-D + 30 g/L Sucrose + 2.5 g/L Phytagel為培養基，pH 5.8，葉盤接種后在（25±2） ℃條件下，分別進行0、7、14、21、28 d的暗處理，在光照度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d的條件下培養，研究不同暗培養時間對晶玉葉片不定芽再生的影響。每個處理80片葉，每處理3次重復。

1.7 不同濃度激素配比對晶玉葉柄不定芽再生的影響

取長勢健壯、三出復葉均展開的晶玉無菌試管苗葉柄，切成1 cm左右的小段與再生培養基接觸進行培養。再生培養基以MS+30 g/L Sucrose+2.5 g/L Phytagel為基本培養基，pH 5.8，分別添加不同濃度的TDZ與2，4-D或IBA的配比，50 d后進行統計，研究不同濃度激素配比對晶玉葉柄不定芽再生的影響。每個處理80個葉柄切段，每處理3次重復。接種后培養條件為：溫度（25±2） ℃、光照度1 500～2 000 lx、光照時間16 h/d。

1.8 晶玉的再生小苗生長與植株生根

將再生的晶玉不定芽在培養基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA上繼代培養1次，當不定芽長至3 cm左右時，將生長健壯的無根小苗接種于不同生根培養基上進行生根培養，25 d后進行觀察統計。通過生根率、平均生根數、平均根長、平均根粗等指標綜合衡量晶玉的最佳生根培養基。

1.9 數據統計

在不定芽再生過程中，持續觀察外植體形態變化及不定芽再生情況。培養50 d后，統計不同處理不定芽再生頻率和每個外植體再生的不定芽個數，計算不定芽再生率及每個外植體再生芽數。

不定芽再生頻率=再生出不定芽的外植體數/接種的外植體總數×100%

每個外植體再生芽數=外植體再生出的不定芽總數/再生出不定芽的外植體數

試驗數據采用Excel 2003軟件進行分析，應用SAS 8.0軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 不同濃度6-BA與IAA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

晶玉葉盤接種于添加了6-BA與IAA不同濃度組合的再生培養基上，愈傷產生量少，且愈傷多為淺綠色、質地較致密堅硬，30 d左右不定芽開始分化。大部分不定芽經愈傷組織分化形成，少量不定芽直接在葉片切口末端形成。如表1所示，不同濃度的6-BA與IAA組合對晶玉葉片不定芽再生的試驗中，該組合總體上能夠誘導葉片不定芽的再生，但再生頻率較低。其中2.0 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA組合對晶玉葉片不定芽再生相對較好，再生率達到19.05%，與其他處理間差異顯著。

2.2 不同濃度TDZ與2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

從表2可以看出，在同一TDZ水平上，晶玉葉片不定芽再生率隨著2，4-D濃度的升高呈顯著下降的趨勢，這說明培養基中附加低濃度（小于0.10 mg/L）的2，4-D有利于晶玉葉片不定芽的再生。葉片接種于添加了TDZ與2，4-D不同濃度組合的再生培養基上，產生愈傷多為黃綠色顆粒狀，質地較致密，25 d左右開始形成不定芽。結果表明，2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生最好，再生率達到81.45%，顯著高于其他處理，平均再生芽數達到4.47個。3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合不定芽再生率也較高，但觀察發現，當TDZ濃度較高時（大于2.0 mg/L），再生出的不定芽玻璃化嚴重，因此TDZ濃度不宜過高，以2.0 mg/L為宜。如圖1所示，圖1a為晶玉葉片接種7 d后在切口邊緣形成明顯的黃綠色愈傷，圖1b為晶玉葉片愈傷再生出的不定芽。

2.3 不同濃度TDZ與IBA組合對晶玉葉片不定芽再生的影響

在TDZ與IBA不同濃度組合的再生培養基上，晶玉葉片多產生黃綠色顆粒狀愈傷、少量為塊狀，質地致密，30 d左右開始形成不定芽。從表3可以看出，2.0 mg/L TDZ+0.3 mg/L IBA組合對培養晶玉葉片不定芽再生效果最好，平均不定芽再生率達到55.96%，顯著高于其他處理，每葉塊平均再生芽數達到3.55個；當TDZ濃度進一步提高到3.0 mg/L時，不定芽再生率開始下降，且不定芽以叢生狀為主，長勢較弱，玻璃化現象嚴重。

2.4 不同暗培養時間對晶玉葉片不定芽再生的影響

不同暗培養時間對晶玉葉片不定芽再生的影響如表4所示。暗培養7 d平均不定芽再生率最高，達到84.53%，每個外植體再生芽數達到5.01個，顯著高于沒有暗培養的處理，表明暗培養對晶玉葉片不定芽的再生有一定促進作用。觀察發現，進行7 d暗培養，可以減輕晶玉葉片切口的褐化現象，這可能是暗培養促進不定芽再生的主要原因。但暗培養時間過長不利于不定芽的分化再生。

2.5 不同濃度激素配比對晶玉葉柄不定芽再生的影響

不同濃度激素配比對晶玉葉柄不定芽再生的影響結果如表5所示。在13種激素組合中，3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對晶玉葉柄不定芽再生效果最好，平均不定芽再生率達到57.83%，顯著高于其他處理，每葉塊平均再生芽數達到3.59個。晶玉葉柄不定芽再生如圖1所示，其中圖1c為晶玉葉柄接種7 d后在切段兩端形成明顯的黃綠色塊狀愈傷，圖1d為葉柄愈傷再生不定芽。

2.6 不同生根培養基對晶玉植株生根的影響

再生出來的晶玉不定芽在繼代培養基上培養1次后生長成小植株，如圖1e所示。在如表6所示的7種生根培養基中，從各項指標綜合考慮，晶玉的最佳生根培養基為1/2 MS+0.05 mg/L NAA+0.05 mg/L IBA，其生根率、平均生根數、平均根長、平均根粗分別達到了99.33%、11.67個、3.04 cm、0.80 mm。晶玉不定芽生根形成的完成植株如圖1f所示。

3 小結與討論

影響草莓再生的因素較多，其中草莓品種自身特性、培養基、不同激素的種類和濃度配比等是關鍵因子。近幾年，湖北省草莓育苗期炭疽病病害發生嚴重[13]，而晶玉是一個對炭疽病具有較高抗性的品種，其在生產上應用潛力較大。晶玉高效的再生體系對于種質交換及進一步的草莓遺傳轉化研究具有重要意義。

激素種類和配比是影響外植體器官發生的重要因素。在離體培養中一般生長素有利于根的形成，而細胞分裂素有利于芽的形成，通過改變二者的比例可以調節芽的形成。在不同類型的激素組合中，以TDZ與2，4-D配合使用時晶玉再生頻率較高，這可能與TDZ強烈的細胞分裂素活性有關。本試驗建立了晶玉的高效離體再生體系，2.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對晶玉葉片不定芽再生的效果最好，再生率達到81.45%；3.0 mg/L TDZ+0.05 mg/L 2，4-D組合對晶玉葉柄不定芽再生的效果最好，再生率達到57.83%。

暗培養也是影響草莓葉片再生率高低的重要因素之一。有相關報道指出[9，14，15]，草莓不同品種再生所需要的合適的暗培養時間各有不同，草莓豐香的最佳暗培養時間是14 d，草莓吐德拉是21 d，草莓幸香是42 d。本研究結果表明，晶玉葉片再生最佳的暗培養時間是7 d。暗培養的主要作用是讓外植體在再生過程中減少溢出酚類物質，減輕褐化，維持植物材料較好的生理狀態[16，17]，因而有利于再生。

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