麻城黑山羊微衛星標記多態性分析

摘要：為了解麻城黑山羊群體的遺傳多樣性，選擇了位于不同染色體上、具有較高多態性的10個微衛星標記，對麻城黑山羊群體進行研究。結果表明，BM1329等10個微衛星標記共檢測到171個等位基因，每個標記都檢測到9個以上（平均為17.1個）的等位基因，有效等位基因數為7.1～18.1個，基因頻率最高的是OarAE101標記的100 bp片段（0.239 1）；10個微衛星標記多態信息含量（PIC）都在0.95以上，均為高度多態標記，遺傳多樣性豐富，其中BMS1591標記的多態信息含量（PIC）最高，為0.996 9，各標記的平均雜合度在0.707 4～0.976 5之間，遺傳雜合度在0.859 0～0.944 6之間，平均遺傳雜合度為0.906 7，屬于高度雜合標記和高度雜合品種，遺傳變異大。

關鍵詞：微衛星標記；遺傳多態性；麻城黑山羊

中圖分類號：S827 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）18-4454-04

麻城黑山羊產于大別山及其周邊的廣大地區，主產區在湖北麻城市，是優良的黑色地方品種資源。對于麻城黑山羊的相關研究，過去多限于體型外貌、體尺測量、生產性能測定等方面，很少在分子水平上開展研究，品種的選育尚停留在常規育種領域，嚴重阻礙了該品種的選育提高和進一步發展。

微衛星（Microsatellite）是廣泛分布于生物基因組中的簡單重復序列，20世紀80年代，Miesfeld等[1]在人類基因組的研究中首先發現了微衛星DNA，它一般由2～6個堿基組成核心單元，重復幾次至幾十次不等，數量龐大且分布均勻，在染色體上平均每10kb就出現一個，同時具備保守性、等顯性遺傳、多態性豐富、易被檢測、進化所受選擇壓力小等特點，在物種遺傳圖譜構建、品種遺傳多樣性分析、種間遺傳距離估測、親子鑒定、數量性狀基因座（QTL）的檢測與定位、雜交優勢預測等方面具有很大的應用價值，也使之成為繼RFLP之后的第二代分子標記技術，被廣泛應用于羊的遺傳育種領域，為羊育種開辟了一條新的途徑。

遺傳多樣性（Genetic diversity）是生物多樣性的基礎和核心。最初采用血液蛋白多態性、酶多態性等來研究群體的遺傳多樣性，但結果的可信度不高。隨著育種技術的發展，從分子水平上為群體遺傳多態性的研究提供了更好的途徑，如微衛星標記既可反映個體的遺傳相似程度，又能反映群體之間的遺傳相似程度，在遺傳多樣性評估、畜禽品種資源的分類、保護和利用等方面具有重要價值。國內外利用微衛星標記對羊品種的遺傳多態性研究非常普遍。Luikart等[2]用22個微衛星標記檢測山羊家系，22個標記的平均雜合度為0.611 0，等位基因數2～11，其中安哥拉山羊平均雜合度為最高。Kim[3]用9個微衛星標記分析朝鮮和中國山羊，共檢出62個等位基因，每個標記都具多態性，等位基因數4～10。Chenyambuga[4]用19個微衛星標記分析非洲山羊品種遺傳多樣性，結果每個標記均表現多態性，等位基因數均大于4。蘭蓉等[5]用11個微衛星標記分析了云南肉山羊黑色品系，得到了品系內不同家系的遺傳多態性信息和公羊間的親緣關系。湯存偉等[6]研究了10個微衛星標記在新疆13個綿羊群體中的遺傳多態性，計算得到的群體平均多態信息含量為0.680 3，平均雜合度為0.719 2。郎俠等[7]用15個微衛星標記分析蘭州大尾羊，共檢測到153個等位基因，群體多態信息含量0.776 2。郭丹等[8]用微衛星標記研究了遼寧絨山羊的遺傳多樣性，7個標記均呈高度多態性，遺傳多樣性豐富。毛楊毅等[9]用微衛星標記研究呂梁黑山羊等4個山西地方山羊品種，5個基因座共檢測到67個等位基因，多態性豐富。

本研究選擇10個微衛星標記，對麻城黑山羊群體進行檢測，統計分析標記的多態性、基因雜合度等，為了解麻城黑山羊的群體遺傳多樣性，進一步尋找與麻城黑山羊毛色、生長、繁殖等相關的遺傳標記提供理論依據，為麻城黑山羊新品系的培育提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

麻城黑山羊血樣，在湖北省麻城黑山羊種羊場采集。所用的試劑包括Tris、EDTA、SDS、蛋白酶K、TaqDNA聚合酶、dNTPs等購自生工生物工程（上海）股份有限公司，微衛星引物10對（引物信息見表1）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2 儀器設備

數顯pH計、高速臺式離心機、PCR擴增儀（普通、梯度）、電泳儀、凝膠成像儀等。

1.3 血樣采集及DNA提取

采集麻城黑山羊靜脈血199頭份，置于低溫保溫箱帶回實驗室。提取DNA，溶解于TE。最終提取出可用的基因組DNA樣品為189頭份。

1.4 PCR擴增

PCR反應體系20 μL：10×Buffer 2 μL，25 mmol/L MgCl2 1.0～2.4 μL，10 mmol/L dNTPs 0.4 μL，8 pmol/μL兩側引物各1 μL，5 U/μL Taq DNA聚合酶0.5 μL，DNA模板1 μL，雙蒸水補充至20 μL。

反應程序：95 ℃預變性8 min；94 ℃變性30 s，53.0～60.0 ℃退火30 s（因標記而異），72 ℃延伸40 s，共38個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。各反應體系引物的MgCl2用量、退火溫度見表2。以2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物。

1.5 統計分析

1.5.1 統計軟件 用Band Scan 5.0軟件獲得等位基因的大小，根據公式計算各微衛星座位的等位基因頻率、 多態信息含量、 雜合度等。

1.5.2 多態信息含量 采用以下公式計算多態信息含量（PIC）。

2 結果與分析

2.1 PCR擴增產物的電泳結果

由圖1可知，BM1329等10個微衛星標記的PCR擴增產物的條帶均為一條或兩條，符合微衛星標記的基本特征，可用于后續的遺傳信息分析。

2.2 微衛星標記的等位基因分析

利用Band Scan 5.0軟件進行微衛星標記的等位基因及基因頻率分析，經統計得知，BM1329等10個微衛星標記共檢測到171個等位基因，每個標記都檢測到9個以上的等位基因，說明所選擇的微衛星標記遺傳信息比較豐富。在所有微衛星標記中，以BMS1591標記檢測到的等位基因數目最多，為23個，其片段大小為187～273 bp；其次是BM143標記，為22個等位基因，其片段大小為78～170 bp；OarHH35標記的等位基因數目最少，只檢測到9個等位基因，片段大小為97～125 bp。

在所有檢測到的等位基因中，以OarAE101標記、100 bp片段的基因頻率最高，為0.239 1，其次是OarHH35標記、97 bp片段的基因頻率（0.234 0）；而BMS2508標記的135 bp片段、OarHH55標記的150 bp片段的基因頻率最低，均為0.002 7。可以看到，所有基因的基因頻率都不高（最高者僅0.239 1），這可能是群體基因分布較均勻等因素所造成。

每個微衛星標記上觀察到的等位基因數及統計后的有效等位基因數如表3所示。有效等位基因數（Ne）反映了群體遺傳變異大小。有效等位基因數接近所檢測到的等位基因的絕對數，表明等位基因分布均勻。根據表3中的數據，BM1329、BM3413、BMS2508和BM143等標記的等位基因觀察數和有效等位基因數都相差較大（絕對相差值在6.7～8.1），說明在這些基因座上，群體的等位基因分布不均勻，遺傳差異較大，這可能是由于地理隔離以及人工選擇所造成。

2.3 多態信息含量與雜合度

多態信息含量（PIC）用來描述微衛星標記的變異程度，用于估計群體內的遺傳變異程度。一般認為，當PIC>0.5時為高度多態標記，0.25

由表4可知，本研究中的10個微衛星標記均為高度多態標記，多態信息含量都在0.95以上，說明基因變異較大，遺傳多樣性豐富，同時也說明本研究所選用的微衛星標記均能提供較好的遺傳信息，可以反映麻城黑山羊群體的遺傳多樣性。其中BMS1591標記的多態信息含量最高，為0.996 9，其次是BM143標記，為0.995 7；OarAE101標記的多態信息含量最低，為0.980 1。10個微衛星標記的平均雜合度（H）在0.707 4～0.976 5之間，群體遺傳雜合度（h）在0.859 0～0.944 6之間，品種的平均群體遺傳雜合度為0.906 7，均屬于高度雜合標記和高度雜合品種。較高的品種雜合度，表明品種的遺傳多樣性信息豐富；較高的微衛星標記雜合度，說明該標記所能提供的遺傳信息量更大。同時，雜合度的高低，還在一定程度上反映了品種的選育過程，如所用的親本材料來源廣泛、或導入了外血、選育時間短，均會提高雜合度。

3 小結與討論

3.1 小結

BM1329等10個微衛星標記共檢測到171個等位基因，平均為17.1個，其中以BMS1591標記檢測到的等位基因數目最多（為23個），其次是BM143標記（22個），OarHH35標記的等位基因數目最少（9個）。基因頻率最高的是OarAE101標記的100 bp片段（0.239 1），其次是OarHH35標記的97 bp片段（0.234 0），而BMS2508標記的135 bp片段、OarHH55標記的150 bp片段的基因頻率最低，均為0.002 7。

10個微衛星標記多態信息含量都在0.95以上，均為高度多態標記，其中BMS1591標記的多態信息含量最高，為0.996 9，其次是BM143標記，為0.995 7；OarAE101標記的多態信息含量最低，為0.980 1。平均雜合度在0.707 4～0.976 5之間，群體遺傳雜合度在0.859 0～0.944 6之間，平均群體遺傳雜合度為0.906 7，屬于高度雜合標記和高度雜合品種，遺傳變異大。

3.2 討論

3.2.1 微衛星座位的選擇 大量的理論研究和實踐表明，研究群體的雜合度、群體間遺傳距離時，所用標記的數目對結果的精確性和可靠性非常重要，數目越多則結果的精確性越高，但工作量和費用相應較高。在本研究中，選用了分布在不同染色體上（10個微衛星標記分別分布在6條染色體上）、多態性較高的標記，以盡可能提供較多的遺傳信息，且擴增產物的片段大小多在80～270 bp之間，便于獲得擴增產物和結果統計。同時，這10個標記已有對羊的生長發育、繁殖等性狀具有正效應的研究結果，便于下一步開展此方面的研究。本研究結果表明，10個微衛星標記均檢測到9個及以上（平均17.1個）的等位基因，多態信息含量非常豐富，客觀地反映了麻城黑山羊的遺傳信息。

3.2.2 電泳 微衛星的PCR擴增產物多采用聚丙烯酰胺凝膠作為載體，在垂直槽上進行電泳，它的分析結果在精確度上高于瓊脂糖法，但凝膠的制備非常麻煩，電泳過程耗時很長，成本也較高。近年來也有采用毛細管電泳的[5]，它是經典電泳技術和現代微柱分離相結合的產物，采用毛細管電泳原理制作的全自動分析儀，具有自動上樣、高通量、檢測靈敏度高、分辨率高、樣本消耗少、分析快速等優點，并可進行全自動數據記錄和輸出膠圖、條帶長度和濃度。本研究采用的是較為傳統的瓊脂糖法，雖然其分辨效果不如前兩種方法，但制膠容易、電泳時間短、效率也較高、成本較低，只要掌握好凝膠濃度、電壓和電泳時間，避免出現條帶未分開、邊緣效應等問題，同樣可取得較理想的分析結果。

3.2.3 關于群體遺傳多樣性 多態信息含量和群體遺傳雜合度都不同程度地反映出品種的遺傳多樣性。在本研究中，麻城黑山羊的平均PIC在0.980 1～0.996 9之間，平均遺傳雜合度在0.859 0～0.944 6之間，說明其遺傳基礎廣泛、遺傳多樣性豐富。而平均雜合度低于平均遺傳雜合度，表明品種中用于配種的種公羊數量較少，存在一定程度的近交，也可能是長期對某一性狀的選擇，造成整體血統狹隘，或是品種曾經歷過始祖效應，這些都會造成基因純合較多。

參考文獻：

[1] MIESFELD R， ARNHEIM. Species-specific rDNA transcription is due to promoter-specific binding factors [J]. Molecular and Cellular Biology，1984，4（2）：221-227.

[2] LUIKART G， BIJUDUVAL M P， ERTUGRUL O， et al. Power of 22 microsatellite markers in fluorescent multiplexes for parentage testing in goats[J]. Animal Genetics，1999，30（6）： 431-438.

[3] KIM K S. Genetic diversity of goats from Korea and China using microsatellite analysis Asian-Australasian[J]. Journal of Animal Sciences，2002，15（4）：461-465.

[4] CHENYAMBUGA S W. Genetic characterization of indigenous goats of Sub-saharan Africa using microsatellite DNA markers Asian-Australasian[J]. Journal of Animal Sciences，2004，17（4）：445-452.

[5] 蘭 蓉，朱 蘭，王 鵬，等.云南肉山羊黑色品系內不同家系遺傳多樣性分析[J].中國草食動物，2012，32（2）：8-12.

[6] 湯存偉，佘 雄，劉武軍，等.新疆13個綿羊群體遺傳多樣性及遺傳分化的研究[J].家畜生態學報，2011（1）：13-19.

[7] 郎 俠，呂瀟瀟.蘭州大尾羊微衛星DNA多態性研究[J].中國畜牧雜志，2011（1）：14-17.

[8] 郭 丹，韓 迪，王春艷，等.遼寧絨山羊7個微衛星位點的遺傳多樣性分析[J].中國畜牧獸醫，2010，37（12）：99-103.

[9] 毛楊毅，羅惠娣，郭慧慧，等.山西4個地方山羊品種的遺傳多樣性分析[J].甘肅農業大學學報，2010，45（5）：15-20.