金桔紅掌離體培養的研究

摘 要：以金桔紅掌葉片為實驗材料，對外植體最佳消毒時間及增殖培養方案的優化進行了研究。結果表明，外植體最佳消毒時間為16min；增殖培養的最佳培養基為3/5MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L；過渡培養的最佳培養基為MS+活性炭1g/L+蔗糖35g/L。

關鍵詞：金桔紅掌；葉片；消毒時間；增殖培養；過渡培養

中圖分類號 S682 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2013）13-41-03

紅掌（Authurium undreanum）為天南星科花燭屬多年生常綠草本植物[1]，原產于中南美洲哥倫比亞西南部，是一種很好的盆花和切花植物。紅掌花葉優美，高貴典雅，是目前國際花卉市場上流行的一種名貴花卉，成為僅次于熱帶蘭的第二大熱帶花卉商品。紅掌由法國著名植物學家Elouard Andr在1896年從哥倫比亞西南部引種到歐洲，比利時人Jean Linden率先栽培并開始銷售，從此便作為商品開始風靡全球。但由于紅掌用常規分株繁殖難以擴大生產，而播種繁殖要經人工授粉才能獲得種子，耗費人力，所以組織培養成為紅掌快速繁殖的唯一途徑。自Pierik[2]于1974年對紅掌進行組織培養取得成功以來，國內外學者對其進行了大量的組織培養的研究，但絕大多數的研究僅限于某一品種或單一器官（莖尖研究最多）。1986年Keller等研究用MS. skoog培養基作葉插（加KT 2mg/L），1～2個月可形成愈傷組織。1990年，Lightboarn等報道0.5mg/L的2，4-D對愈傷組織的誘導效果最好，增加NH4NO3濃度可使葉片愈傷組織增殖加快。1999年，Kuehrle-A等用4種雜交種幼苗的葉進行組培，發現在暗培養1個月后有半透明的胚胎發生。23個月后，用MS+6-BA 0.2mg/L+2.0%蔗糖繼代培養，成苗后移入溫室。1993年，復旦大學研究表明[3]，在幼苗微培養中，晝長夜短可誘導愈傷組織生長；3.0%葡萄糖對愈傷組織形成是最有效的。我國從1998年開始研究[4]，現已成功掌握了植株再生體系的建立、繼代增殖培養、壯苗和生根培養、移栽和溫室育苗等技術。研究人員通過采用不同的器官作為外植體，對不同培養基進行篩選比較，總結出一套較為完整的操作流程。不同的品種培養技術會有差異，在不斷引進新品種的同時研究其組織培養技術具有現實意義。

金桔紅掌（Anthurium Golden Orange）為天南星科花燭屬，葉寬橢圓狀心臟形，全緣，綠色，是從紅掌變異品種中經過選育而成的具有觀賞潛力的新品種。筆者以金桔紅掌為原材料，對外植體最佳消毒時間及增殖培養方案的優化進行了研究，其目的是降低污染率，從而提高金桔紅掌的成活率以及金桔紅掌的增殖倍率，對金桔紅掌的離體培養有重要意義，也為以后紅掌新品種的選育作一個參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 實驗于2012年春在廣東華力園藝有限公司實驗基地進行。材料為金桔紅掌葉片，金桔紅掌從該公司華倫天奴品種中選出。株高31.8cm，葉寬橢圓狀心臟形，全緣，綠色。花梗從葉腋處抽生，佛焰苞苞片長6.9cm，寬7.2cm，苞片顏色前期為桔紅色，頂部帶綠色。花序長4.8cm，粗為1cm，花序初為桔黃色，后為下白上桔紅，之后逐漸變為綠色。花梗長31.3cm，桔紅色至暗紅色。

1.2 方法

1.2.1 金桔紅掌外植體消毒時間試驗 選擇好的母株置于干凈、通風良好的溫室中，整個處理過程中不施肥、不澆水，處理后植株呈萎蔫狀態，基質土壤不濕潤、不沾手即可做種。選擇無病蟲害植株的葉片，在預處理室通過精心處理之后用0.05%洗衣粉溶液清洗3～5min，然后帶回接種室，再用1‰的升汞溶液分別消毒12、16、18min，消毒完畢后用無菌水清洗3～5遍，切下葉片四周升汞侵蝕部位，接種于培養基中。外植體為金桔葉片，每個處理16片；誘導培養基：MS，pH值6.0；La（卡拉膠）5.5g/L；蔗糖30g/L。培養條件：光照強度1 500lx左右，光照時間12±0.5h/d，溫度26±1℃，培養周期為6周（圖1）。

<＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-1-4.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-1-1.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-1-2.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-1-3.tif>[母本圖片][外植體][初代愈傷長勢][初代切割后]

圖1 實驗材料

在培養6周后，觀測真菌污染數、細菌污染數，計算真菌污染率、細菌污染率及成活率，計算方法為：真菌污染率（%）=真菌污染數/接種總數×100，細菌污染率（%）=細菌污染數/接種總數×100，成活率（%）=成活數/接種總數×100。

1.2.2 金桔紅掌芽的增殖誘導培養基優選 選擇經過31周繼代培養的生長良好的健康金桔紅掌苗作為實驗材料，在超凈工作臺上進行接種，其接種操作方法為：按方向性切割，2～3芽/團，芽高5～15mm或愈傷團塊直徑6～10mm；單芽高度超過15mm，從基部切下置于團塊旁增殖；剔除根、黃化葉及死亡組織；去除扭曲、拔節芽，置于培養基中。分別用A、B、C、D、E 5種培養基做增殖培養（見表1），進行比較。培養條件為：光強1 500lx左右，光照時間14h/d，溫度26±1℃（圖2）。

表1 金桔紅掌的增殖培養基

[處理＼增殖培養基＼A＼1/2 MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.03mg/L＼B＼1/2 MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L＼C＼3/5 MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L＼D＼3/5 MS+6-BA 0.3mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L＼E＼1/2 MS+6-BA 1.Omg/L+IBA 0.5mg/L＼]

<＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-2-5.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-2-1.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-2-2.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-2-3.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-2-4.tif>

圖2 增殖圖片

在培養30d后，觀測增殖系數，計算方法為：增殖系數=材料切割后團塊數/未切割前團塊數。

1.2.3 金桔紅掌芽的生根誘導培養基優選 選擇經過31周繼代培養的生長良好的健康金桔紅掌苗作為實驗材料，進行過渡培養，過渡培養的目的是為了減少苗的污染和變異，同時提高生根系數，增加產量。過渡的接種操作方法為：選擇無病毒無變異的苗，進行方向性切割，每2～3芽/團，無需去頂，切除多余的基部，置于培養基中。過渡培養選擇A、B、C、D 4種培養基（見表2）進行比較。培養條件為光強1 500～2 000lx，時間12～14h/d，溫度25±1℃（圖3）。

表2 金桔紅掌的生根培養基

[處理＼生根培養基＼A＼MS+活性炭1g/L+蔗糖30g/L＼B＼MS+活性炭1g/L+蔗糖35g/L＼C＼MS+活性炭1g/L+蔗糖40g/L＼D＼MS+NAA 3mg/L+IBA 1mg/L+活性炭1g/L+蔗糖40g/L ＼]

<＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-3-1.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-3-2.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-3-3.tif><＼＼Pc10＼PC10E （E）＼姜秀紅＼雜志＼安徽農學通報雜志＼農學通報2013-13＼3823-3-4.tif>

圖3 過渡試驗圖片

在培養30d后，觀測生根系數，生根系數=已生根團塊數/所用材料總團塊數。

2 結果與分析

2.1 不同消毒時間對外植體培養的影響 不同消毒時間對金桔紅掌原種制作的影響見表3。金桔紅掌外植體總成活率26.53%，總真菌污染為24.48%，總死亡率48.97%。在消毒時間為12min時，真菌污染最多，消毒時間為18min時出現死亡的最多，只有在消毒時間為16min時，外植體的成活率最高。實驗結果表明，消毒時間過短，則消毒不徹底導致真菌污染嚴重，影響外植體成活率；消毒時間過長則增加外植體死亡率。所以，選擇外植體消毒時間為16min最適合。

表3 不同消毒時間對金桔紅掌組織培養的影響

[處理

（min）＼外植體數量

（個）＼真菌污染率

（%）＼細菌污染率

（%）＼死亡率（%）＼成活率

（%）＼12＼16＼7.3＼0＼7.3＼3.2＼16＼16＼1.2＼0＼6.2＼7.1＼18＼16＼4.6＼0＼11.4＼3.5＼]

2.2 不同培養基對金桔紅掌增殖培養的影響 由表4看出，比較培養基A和B，培養基B中添加了IBA 0.05mg/L，增殖系數增加了0.11。由此可知，添加IBA有利于增殖系數的提高。培養基C和D中，只有6-BA的濃度有所不同，濃度高的其增殖系數低一些。比較培養基A、B、C、D、E可以看出，培養基E中，激素6-BA、IBA結合利于增殖系數的提高，并使增殖系數達到最大值；然而，6-BA、IBA、NAA結（下轉157頁）（上接42頁）合更有利于材料生長，而且株型較好，葉片展開度也較佳。綜合得出，培養基3/5MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L最佳，若只用于增殖生產，使用培養基1/2MS+6-BA 1.0mg/L+IBA 0.5mg/L最佳。

表4 不同培養基對金桔紅掌增殖培養的影響

[處理＼外植體數量（個）＼增殖系數＼生長情況＼A＼120＼1.96＼芽壯、根多＼B＼120＼2.07＼根多、芽長勢一般＼C＼120＼2.34＼根多，芽比較壯＼D＼120＼2.15＼芽壯、有根，長勢較好＼E＼120＼3.05＼根少、芽點多、抽起的芽少＼]

2.3 不同培養基對金桔紅掌生根培養的影響 由表5可以看出，A、B、C 3種培養基只有蔗糖濃度有差異，通過比較三者的生根系數可知，在培養基中蔗糖濃度過低、過高均會降低生根系數，尤其是當蔗糖濃度過高時還會出現苗生長不太正常的現象。培養基C和D比較，D的生根系數要高，可見在培養基中添加適當的激素會提高生根系數。比較4種培養基可知，以培養基B（MS+活性炭1g/L+蔗糖35g/L）的生根系數最高，長勢最好。

表5 不同培養基對金桔紅掌生根培養中生根系數和生長的影響

[處理＼原材料（團）＼生根系數＼生長情況＼A＼120＼0.76＼長勢正常＼B＼120＼0.81＼長勢好、葉寬正常＼C＼120＼0.70＼葉寬偏小＼D＼120＼0.73＼長勢一般＼]

3 結論與討論

作為時尚盆花和切花的紅掌，越來越受到人們的喜愛和重視，組織培養是紅掌繁殖的重要方法，其中，通過外植體獲得愈傷組織是紅掌組培快繁的關鍵步驟，愈傷組織誘導成功與否與外植體的取材部位、消毒方法、誘導培養基都有密切關系[5]。

金桔紅掌葉片組織培養中，由于培養器皿、培養基、培養材料、操作器械等消毒不徹底，或者操作不謹慎、接種環境和培養環境不清潔等因素引起細菌以及真菌的污染。避免污染的主要方法是外植體的消毒，消毒時間短，污染率就高；消毒時間長，易殺死外植體[6-7]。合理控制消毒時間是獲得紅掌組培苗的關鍵。本實驗中，隨著消毒時間的延長，紅掌的成活率呈上升趨勢，污染率逐漸下降。但消毒時間過長，則使外植體出現死亡。所以金桔紅掌選擇外植體消毒時間為16min最適合。

大多數有關紅掌組織培養的研究側重于愈傷組織誘導培養基的選擇。本研究表明，激素IBA、NAA結合對材料生根系數影響不大，這與趙衛國等的研究不同。趙衛國[8]等的研究表明NAA可以促進紅掌提早生根，且產生的根系粗壯，但是根系短，根毛多且根為黃色；添加適量糖有利于材料生長，本研究也得出與之相似的結果。綜合來看，在4種優選的培養基中，金桔紅掌過渡培養的最佳培養基是MS+活性炭1g/L+蔗糖35g/L。

芽分化和增殖是影響紅掌快繁效率的主要因素。夏時云等[9]研究發現，BA是影響愈傷組織芽分化最重要的激素。另有研究表明，愈傷組織芽分化往往是多種激素相互平衡及協同作用的結果，激素配比尤為重要[10]。一般認為，細胞分裂素和生長素的比例是影響增殖系數和不定芽質量的主要因素[11-12]。在紅掌不定芽誘導分化過程中，IBA是適合紅掌不定芽誘導的生長素，對不定芽的誘導效果優于NAA。因此實驗結果表明，培養基3/5MS+6-BA 0.2mg/L+IBA 0.05mg/L+NAA 0.03mg/L是金桔紅掌增殖培養的最佳培養基。

參考文獻

[1]胡軍民.安祖花[J].中國花卉園藝，2002（5）：39.

[2]Pierik R L M. Anthurium andraeanum plantlets produced from callus t issue cultivated in vitro[J].Physiol Plant，1976，37（1）：80-82.

[3]江如藍，張施君，鄭迎冬，等.紅掌的組織培養和快速繁殖[J].仲愷農業技術學報，2002，15（4）：49-53.

[4]呂復兵，王碧青，廖飛雄，等.紅掌葉片離體培養與植株再生研究[J].廣東農業科學，2002（6）：25-26.

[5]陳海，黃小江，林思誠，等.紅掌組織培養和快速繁殖技術[J].廣西熱帶農業，2009（3）：6-8.

[6]梁稱福.植物組織培養研究進展與應用概況[J].經濟林研究，2005，23（4）：103-109.

[7]馬紹餐，金青，聶凡，等. 消毒時間和激素水平對小水榕組織培養的影響[J].農業生物技術科學，2007，23（11）：90-94.

[8]趙衛國，石嶺，高雷，等.生長素的種類和濃度對紅掌組培苗生根的影響[J]. 農業生物技術科學，2007，23（13）：92-96.

[9]黃萍萍.紅掌快速繁殖技術研究[J].黎明職業大學學報，2004（1）：60.

[10]朱飽卿，柴向華，李軍，等.紅掌的花序培養及快速繁殖技術研究[J].中國農學通報，2004，20（4）：226-227.

[11]Shevade A，Preece J E.In Vitro Shoot and Floral Organgenesis from Stamen Explants from a Rhododendron“P.J.M”Group Clone[J].Scientia Horticulture，1993，56：163-170.

[12]Economou A S，Read P E.In Vitro Shoot Proliferation of Minnesota. Deciduous Azaleas[J].Hortscience，1984，19（1）：60-62.