DNA在金薄膜表面上的拉直研究

摘 要：實驗研究了DNA分子在金薄膜表面的拉直方法。結果表明，將10ng/μlDNA拉直在APS-金膜上，DNA在Au薄膜表面的AFM圖像顯示DNA條數極為稀少，但是舒展的很直，采用高濃度的DNA溶液，發現DNA的概率幾乎沒有提高；將DNA在Au薄膜表面直接拉直沉積，其濃度在0.1-0.2ng/μl之間較為合適。

關鍵詞：DNA；金薄膜；APS；拉直

需要拉直DNA的原因有許多。用拉直反轉錄DNA制備芯片標記，可以增強吸附序列的接近和提高它們的密度。在基因組分析中，將DNA樣品拉直在固體表面后，由于可以準確的獲知探針結合的空間位置，己經被廣泛地應用于限制性內切酶圖譜的光學繪圖[1]和各種雜交研究[2]，在DNA復制與轉錄、基因組的缺失與重排、疾病基因的定位等方面顯示了巨大的應用價值[3]。拉直的DNA還可以用于單分子測序，一種策略是用外切酶從拉直的DNA分子一端依次切下單個堿基[4]，另一種設想就是用掃描探針技術，AFM或STM來直接讀取測序[5]，這樣就需要將DNA梳直在薄膜電極的表面，金薄膜就是很好的導電電極，本文主要研究了將DNA拉直在金薄膜電極上的實驗方法，為用掃描探針技術進行DNA單分子測序提供參考和借鑒。

1 實驗材料和儀器

小牛胸腺DNA纖維、3-氨基丙基三乙氧基硅烷（a-aminopropyl trie th oxy silane， APS）購自SIGMA公司；云母為國產褐云母；Parafilm 膜購自美國American National Can 公司；實驗用水為四次蒸餾水；TE緩沖液為40mMol/L Tris-Hcl和5mMol/L EDTA混合溶液其PH值為8.0。

AFM為俄羅斯NT-MDT公司產品（P47-Ⅲ）；針尖購自俄羅斯Silicon MDT公司。

利用沈陽科儀公司生產的激光分子束外延（L-MBE）系統，使用KrF準分子激光，脈沖能量為110mJ，頻率為8Hz，制備了金薄膜，其AFM形貌如圖1所示。實驗所用靶材為99.999%的Au靶，真空為1.2×10-7Pa。為了保證薄膜的均勻性，在制備過程中襯底與靶材保持同速旋轉。為了得到粗糙度較小薄膜，薄膜襯底選用新解理的云母片，薄膜厚度約為70nm。

2 實驗結果與分析

2.1 在APS-Au膜上拉直DNA

Au膜本身不能吸附DNA分子。新鮮的云母表面也不能吸附DNA，但用APS處理后，云母表面可以吸附DNA。我們用類似的方法處理Au膜。Au膜用10%的APS溶液浸泡3分鐘，用四次蒸餾水充分沖洗后，吹干形成APS-金膜。處理后的Au膜表面可以吸附個別的DNA分子。將10ng/μlDNA按照“動態分子梳”Dynamic MolecularC ombing，D MC）方法[6]的方法鋪在APS-金膜上，圖2為吸附了DNA的Au表面的AFM圖像，可見DNA極為稀少，但是舒展的很直。

APS處理的Au表面之所以能夠吸附DNA分子，事實上仍然是APS本身的作用。APS不能和Au結合，Au膜是由納米顆粒組成的疏松薄膜，當Au薄膜上的APS溶液被洗凈吹干后，最表層的APS雖然被去除，但在由于APS溶液的表面張力較水要小，顆?？p隙之間仍然殘留少量APS。對于粗糙的表面，縫隙中的APS離表面較遠，DNA分子與表面接觸時，不能與APS接觸，因而不能被吸附。但表面較平整的Au膜上，APS可以與溶液中的DNA分子接觸，因而可以吸附DNA。實驗發現這種方法雖然能拉直DNA，但是不同Au薄膜的粗糙度不同，就是同一薄膜不同宏觀點粗糙度也不同，因此掃描到DNA的概率小于10%；若采用高濃度的DNA溶液，發現DNA的概率幾乎沒有提高。

2.2 直接拉直沉積

基于以上的分析，嘗試將DNA在Au薄膜表面直接拉直沉積。根據分子梳方法的原理[6]，只要將DNA溶液降低到合適的濃度，然后將10μl DNA溶液滴在Au薄膜表面則隨著液滴的干燥，DNA就被自然拉直在Au薄膜表面。實驗發現DNA濃度在0.1 -0.2 ng/μl之間較為合適，其AFM形貌圖如圖3所示。

3 結束語

實驗研究了DNA分子在金薄膜表面的拉直方法。結果表明，將10ng/μlDNA拉直在APS-金膜上，DNA條數極為稀少，若采用高濃度的DNA溶液，但發現DNA的概率幾乎沒有提高；將DNA在Au薄膜表面直接拉直沉積，其濃度在0.1 -0.2 ng/μl之間較為合適。此結果為用掃描探針技術進行DNA單分子測序提供參考和借鑒。

參考文獻

[1]Schwartz D C， Li X， H ernandezL I， etc. Ordered restriction maps of Saccharomyces cerevisiae chromosomes Constructed by optical mapping[J]. Science， 1993， 262：110-114.

[2]Schena M， Shalon D， Davis R W， etc. Quantitative monitoring of gene expression paterns with acomplementary DNA microarray[J]. Science， 1995， 270： 467-470.

[3]Hdrrick J， Michalet X， Conti C， ect. Quantifying single gene copy number by measuring fluoerscent probe lengths on combed genomic DNA[J]. Proc Nad Acad Sci， USA 2000， 97： 222-227.

[4]Brakmann S， Lobermann S. A further step towards single-molecule sequencing： Escherichia coli exonuclease III degrades DNA that is fluorescently labeled at each base pair[J]. Angew Chem Int Ed.， 2002， 41： 3215-3217.

[5]Michalet X. Stretching single-stranded DNA on a surface[J]. Nano Leters 2001，1： 341- 343.

[6]Lamb J R. Straightening out DNA replication-molecular combing[J]. DDT， 2001， 6： 986-987.