大鼠缺血再灌注損傷腎臟組織中褪黑素受體表達情況研究

[摘要] 目的 研究褪黑素受體（MR）在缺血再灌注損傷（I/R）大鼠腎臟組織中的表達情況及意義。 方法 24只健康雄性SD大鼠隨機分為正常組、假手術組和腎臟I/R組，每組8只。采用雙側腎蒂夾閉60 min后再灌注建立I/R腎臟損傷動物模型。術后24 h常規生化法檢測血肌酐、尿素氮的水平，HE染色觀察腎臟組織學改變。熒光定量PCR（RT-PCR）檢測腎臟組織中褪黑素受體MT含量。 結果 以U6為內參基因，熒光定量PCR顯示正常情況下大鼠腎臟組織中MR1和MR2 mRNA表達強度分別為（0.75±0.16）和（0.64±0.10），I/R處理24 h后腎臟組織中MR1和MR2的表達強度分別為（0.37±0.08）和（0.28±0.05），較正常組和假手術組顯著下降（P < 0.01）。 結論 MR在I/R損傷大鼠腎臟組織中的表達明顯下降，提示MR表達與腎臟應激損傷相關，可能作為判斷腎臟I/R損傷程度的指標或治療的靶點。

[關鍵詞] 褪黑素受體；再灌注損傷；腎臟

[中圖分類號] R692 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）20-0001-03

腎臟為高灌注器官，因而缺血再灌注損傷（I/R）在缺血性急性腎損傷的病理過程中起重要作用，是臨床常見的一個多因素、多途徑的復雜的病理過程[1]。然而，I/R的發生機制尚未完全闡明，目前認為氧自由基是I/R發病過程中的重要因素[2]。褪黑素（melatonin，MT）是松果腺分泌的神經內分泌激素，具有廣泛的生理作用，如抗氧化、抗衰老、抗腫瘤及調節免疫系統等。研究證實，MT主要通過直接清除自由基和調節抗氧化酶發揮抗氧化作用[3，4]。褪黑素受體（MR）在人體器官組織中廣泛分布，褪黑素與其特異性膜受體結合后發揮生物學效應。研究證實，應激狀態時組織細胞中MR降低[5，6]。本實驗我們建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型，通過研究MR在缺血再灌注損傷大鼠腎臟的表達水平，進一步闡明I/R的發生機制以及MR在I/R中的作用。

1 材料與方法

1.1 動物模型的建立及分組

選取體重為250～280 g的SD大鼠24只，分為以下3組：①缺血再灌注組（n = 8）：2%戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠（45 mg/kg體重），500 u肝素鈉腹腔注射，進腹后游離雙側腎臟，切除右腎，夾閉左腎動、靜脈45 min，然后開放，縫合腹壁。②假手術組（n = 8）：手術步驟與缺血再灌注組相同，但僅切除右腎，不夾閉左腎動、靜脈。③正常對照組（n = 8）：大鼠正常喂養，不做任何預處理。

1.2 主要儀器和試劑

Trizol試劑（美國GIBCO公司）；Taq DNA聚合酶（日本Takara公司）；10000×SYBR Green（美國Invitrogen公司）；MMLV反轉錄酶和RNA酶抑制劑（美國epicentre公司）；UniCalD×C800全自動生化儀（美國Beckman公司）；ABI PRISM 7900 實時熒光定量PCR儀（美國ABI公司）；MTI、MT2受體引物、U6引物由上海英俊生物有限公司提供。

1.3 標本采集和處理

實驗大鼠分別于手術24 h后開腹經腹腔靜脈采血，3 000 rpm/min離心15 min，取上清（血清）用于血肌酐和尿素氮水平檢測。處死各組大鼠，獲取腎臟組織。一部分在無RNA酶的研磨器內加液氮反復研磨成粉狀，然后每50～100 mg組織樣品，加入1 mL的TRIZOL試劑，置于1.5 mL微量離心管并充分混勻，置于-80°C冰箱備用；另一部分用10%中性甲醛溶液固定后，常規石蠟包埋。

1.4 觀察指標

①腎功能檢測：采用日本Olympus公司Au2700型全自動生化分析儀檢測大鼠血清尿素氮（BUN）及肌酐（Cr）濃度水平。②腎組織的病理學觀察：取各組大鼠同一部位腎臟組織常規制成石蠟標本，切片行HE染色，200倍光鏡下觀察腎間質小管病變程度。

1.5 RT-PCR測定MT1和MT2表達水平

MR1、MR2受體引物、U6引物由上海英俊生物有限公司提供（引物序列見表1）。①總RNA的提取：采用Trizol法提取血清總RNA，異丙醇法濃縮RNA。NanoDrop ND-1000測定RNA濃度并評估純度，Agilent 2100 Bioanalyzer檢測RNA分子完整性。②逆轉錄反應：使用MMLV反轉錄酶進行逆轉錄反應（按epicentre公司說明書規范操作）。③熒光定量PCR反應：將試劑按說明書要求加入于反應管中并置于PCR儀上。反應條件如下：94℃ 1 min， 55℃ 1 min，72℃ 2 min延伸，40個循環。擴增反應結束后繼續從72℃緩慢加熱到99℃以建立PCR產物的熔解曲線（每5秒升高1℃），實驗重復三次。④數據采用2-ΔΔCT法（CT值定義為每個反應管內的熒光信號到達設定閾值時所經歷的循環數）對MR1和MR2 表達進行分析。

表1 RT-PCR的引物序列

1.6 統計學分析

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。計量資料采用均數±標準差（x±s）表示，各組數據的組間差異的分析采用方差分析和t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清尿素氮及肌酐濃度水平比較

正常情況下，大鼠血清BUN和Cr濃度分別為（6.87±1.54） mmol/L和（24.17±4.29） μmol/L。缺血再灌注組大鼠血清BUN和Cr濃度分別為（34.73±7.95） mmol/L和（124.65±25.33） μmol/L，明顯高于正常組大鼠（P < 0.01）。假手術組大鼠血清BUN和Cr濃度略有升高，但和正常大鼠相比較差異不顯著（P > 0.05），見表 2。

2.2 各組大鼠腎臟組織形態學變化觀察

光鏡下缺血再灌注組大鼠腎臟可見近曲小管出現上皮細胞空泡變性、壞死和管腔擴張，其中可見管型和脫落細胞，間質水腫。假手術組大鼠腎小管基底膜完整，小管上皮細胞結構清晰，未見明顯損傷。采用Paller法對腎小管損傷程度評分：每高倍鏡視野隨機選擇10個腎小管計分，腎小管明顯擴張、細胞扁平1分；刷狀緣損傷1分，脫落2分；管型2分，腎小管管腔內有脫落的、壞死的細胞（未成管型或細胞碎片）計1分。缺血再灌注組大鼠腎臟Paller評分結果明顯高于正常組和假手術組（P < 0.01），見表 2。

表2 各組大鼠腎功能水平和腎組織Paller評分（x±s）

注：★與正常組比較，t = 5.878，P < 0.01；▲與正常組比較，t = 13.469，P < 0.01；※與正常組比較，t = 10.074，P < 0.01

2.3 MR1和MR2各實驗組大鼠腎臟組織中的表達情況

以U6為內參基因，熒光定量PCR顯示正常情況下大鼠腎臟組織中MR1和MR2 mRNA表達強度分別為（0.75±0.16）和（0.64±0.10），I/R處理24 h后腎臟組織中MR1和MR2的表達強度分別為（0.37±0.08）和（0.28±0.05），較正常組和假手術組顯著下降（P < 0.01）（圖 1）。

圖1 各組大鼠腎組織MT1和MT2表達情況

3 討論

腎臟缺血再灌注損傷的發病機制非常復雜，至今仍未完全闡明。其病理過程主要為缺血階段和再灌注階段：缺血階段是指由于血流量下降而使腎組織缺血缺氧的狀態；再灌注階段則是使缺血的組織恢復血流的過程，但是再灌注的過程可以進一步加重缺血性組織的損傷。目前認為氧化應激狀態是導致腎缺血再灌注損傷的重要因素之一。其通過大量產生內氧自由基（OFR）使脂質過氧化破壞生物膜，而且還可以引起蛋白質、核酸損傷而導致細胞死亡[7]。此外，缺血缺氧后引起細胞內Ca2+的增加，形成Ca2+超載。腎小管上皮細胞和腎實質細胞所產生的腫瘤壞死因子（TNF）、白細胞介素1、6、8（IL-1、6、8）等炎性因子和活性氧族也會加重缺血再灌注損傷[8，9]。

目前研究發現褪黑素是一種作用很強的內源性抗氧化劑，能夠直接清除和抑制氧自由基產生， 抑制脂質過氧化反應，減少氧自由基引起的Ca2+超載，還能增強內源性抗氧化酶的作用。因此褪黑素對心、腦、肝等器官缺血再灌注損傷具有較強的保護作用[10，11]。褪黑素受體（MR）屬G 蛋白偶聯受體超家族（GPCRs）。G蛋白系統主要分為刺激性G蛋白（Gs）及抑制性G蛋白（Gi）系統。MR為膜受體， 通過特異性與褪黑素結合發揮生物學效應。目前研究證實，人體內許多組織器官都有褪黑素受體表達，其中主要為MRI和MR2 兩種亞型[12]。研究發現，生理狀態的改變或病理狀態下，人體褪黑素受體含量會隨之發生改變[13，14]。有研究顯示，在生理性狀態下，大鼠游泳前后體內MT和MR的表達水平會發生改變，提示在應激狀態下MT 升高的同時而MR 水平降低。王瑩等[15]報道缺血性腦損傷中，大鼠腎上腺組織MT 升高、MR 降低，給予外源性MT 可抑制缺氧缺血導致的過度應激損傷，提示MT 和MR 在機體抗應激過程中起一定作用。

本實驗研究結果顯示，正常情況下大鼠腎組織中褪黑素受體MR1和MR2 mRNA表達強度分別為（0.75±0.16）和（0.64±0.10），缺血再灌注應激可以導致大鼠腎組織中褪黑素受體表達水平明顯下調，I/R處理24 h后腎臟組織中MR1和MR2的表達強度分別為（0.37±0.08）和（0.28±0.05），較正常組和假手術組顯著下降（P < 0.01）。假手術組大鼠腎臟組織中MR表達水平較正常略有下降，但是并不明顯。以上的研究數據提示，MR表達水平的下降與應激狀態下腎臟組織損傷程度有關。即應激導致的損傷程度越重，MR的表達水平越低。這與前面的文獻報道是一致的。

總之，我們的研究表明應激器官組織中MR表達水平不僅可以反映應激損傷程度，而且其水平變化程度也可能參與調控應激過程。因此，進一步研究MR在腎臟I/R損傷中的作用及其機制，不僅能夠提高我們對MR與相關疾病關系的認識和診療水平，也將為臨床有效治療腎臟I/R損傷提供新的思路和方法。

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（收稿日期：2013-01-04）