50例胃腸道間質瘤患者c—kit及PDGFR—a基因檢測及突變分析

[摘要] 目的 研究分析胃腸道間質瘤（GIST）中c-kit基因及PDGFRα基因突變特點與規律。 方法 用PCR擴增和基因測序的方法檢測50例胃腸道間質瘤組織中c-kit基因第9、11、13外顯子和PDGFRΑ基因第12、18外顯子的序列。 結果 在50例成功檢測序列的GIST中共檢測到c-kit基因突變32例， PDGFRα基因的突變共檢測到2例。 結論 ①大部分的GIST存在c-kit基因的突變，在無c-kit基因突變的GIST中有一部分存在PDGFRα基因的突變。②c-kit基因突變主要集中在第11號外顯子。突變的方式頻率由高到低依次為點突變、缺失突變和串聯重復插入。③胃GIST中c-kit exon11 突變率較小腸、結直腸及胃腸道外GIST的突變率高。

[關鍵詞] 胃腸道間質瘤；c-kit基因；PDGFR-α基因；基因突變

[中圖分類號] R735.2 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）23-0054-03

胃腸道間質瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，約占全部胃腸道腫瘤的1%～2%，發病率有不斷升高的趨勢。21世紀90年代以來，隨著Maeda[1]，Huizinga， kindblom， Hirota[2]，Heinrich等為代表的學者們的不懈努力，現已基本闡明其發病機制，GIST中存在c-kit基因功能獲得性突變或血小板衍生生長因子受體α （PDGFRα）的基因功能獲得性突變，走出了長期以來對該病的認識誤區。本文我們收集了深圳市第二人民醫院及湘雅醫院近幾年的胃腸道間質瘤患者手術后腫瘤組織進行基因擴增和直接測序的方法檢測腫瘤c-kit基因9、11、13號外顯子及PDGFRα基因12、18號外顯子的突變情況，分析并揭示胃腸道間質瘤基因突變特點。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取深圳市第二人民醫院和湘雅醫院2008年8月～2012年6月收治的、經手術與病理組織學及免疫組化證實的、資料完整的胃腸道間質瘤病例62例，收集術后腫瘤組織或切片進行基因檢測。所有患者術前均未接受化療、放療、免疫治療及其他針對腫瘤的治療。本組成功檢測基因序列50例，12例因未能成功提取基因組DNA予以剔除。

1.2石蠟組織或新鮮腫瘤組織基因組DNA抽提

采用組織/細胞基因組DNA快速提取試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）。見圖1。引物合成，查閱文獻[3]，根據KIT及PDGFRα基因序列（表1），由上海生物工程技術服務有限公司合成。PCR擴增產物，2%瓊脂糖凝膠上進行電泳，紫外燈下檢測擴增片段檢測（圖2）。挑選條帶明晰的樣品送測序。

1.3 突變分析

測序結果與NCBI基因庫中c-kit和PDGFRα基因序列進行比對（網址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）。

2 結果

2.1基因突變與GIST發生部位的分析

本組50例GIST，腫瘤原發于胃27例，小腸15例，結直腸6例，胃腸道外（包括腹膜、盆腔）2例。通過SPSS分析發現由于原發于結直腸及胃腸道外的病例數較少，單獨分為兩組無法進行可信的卡方檢驗，獲得可信的結論，因此將結直腸及胃腸道外歸為一組進行分析。原發部位與總突變率及c-kit 11外顯子突變率之間關系（表2），從表2中可見，基因突變發生率在不同的部位有差異。隨后進行兩兩比較發現，原發于胃組的基因總突變率及c-kit外顯子11突變率均較其他部位高，差異具有顯著性（χ2=5.061，P = 0.024； χ2=7.346， P = 0.007）；（χ2=4.20，P = 0.04； χ2=8.75，P = 0.013）。

2.2腫瘤大小與基因突變

不同腫瘤大小與總突變率及ckit外顯子11突變率的關系見表3，經分析檢驗，基因總突變率以及c-kit外顯子11突變率在不同腫瘤大小間沒有差異（χ2=0.079， P =0.961； χ2=0.019， P = 0.991）， 隨后根據外顯子11不同突變形式分組，比較不同突變形式在不同腫瘤大小間是否有差異，結果發現三者無顯著性差異（χ2=0.177，P = 0.915； χ2=0.059，P = 0.971； χ2=0.829，P = 0.661）。

3 討論

本組本組50例胃腸道間質瘤中共檢測到c-kit基因突變32例，其中11號外顯子突變30例，占c-kit突變病例的93.8%；9號外顯子突變1例，占2.94%，13號外顯子突變1例。存在c-kit突變的GIST均有KIT蛋白的表達即CD117均為陽性，占全部CD117陽性病例的69.56%（32/46），PDGFRα基因突變2例。通過分析我們可以發現基因突變如下特點。

3.1 大多數的GIST中存在c-kit基因突變

我們檢測50例GIST中檢測到c-kit突變32例，突變率64%，與文獻報道突變率19.6%～92%[4-6]相近。c-kit基因突變以編碼胞內近膜區的11外顯子常見（圖3、圖4），9號外顯子相對較少，本研究發現1例雜合性突變（圖5）。檢出11外顯子突變30例，突變率60% ，與文獻報道的52%～66%的突變率相近[7，8]。c-kit基因突變有集中趨勢， 11號外顯子的突變多集中于第550-560和第570-580密碼子。突變的方式有缺失突變、點突變和插入重復突變。

3.2 部分沒有c-kit突變的GIST中檢測到PDGFRα基因突變

以18外顯子的突變常見，本組中共檢測到2例PDGFRα基因突變， 18外顯子的突變1例， 12外顯子突變1例，均發生于胃，與PDGFRα基因的突變與c-kit基因突變相互獨立報道[9]相符，PDGFRα基因的突變為GIST發病機制之一。

3.3關于c-kit基因外顯子9突變特點

文獻報道[10，11]主要表現為編碼丙氨酸（Ala）和酪氨酸（Tyr）的第502和503個密碼子的6個核苷酸（GCCTAT）的串聯插入重復，以小腸GIST多見。我們檢測到1例9號外顯子突變，符合以上特點。

3.4 PDGFRα基因外顯子12的點突變，未見文獻報道

第566位密碼子AGC突變為ATC，其編碼的絲氨酸（Ger）突變為異亮氨酸（Ile）。可能是新的突變點，見圖6。

3.5 50例標本中有16例GIST未檢測到c-kit基因或PDGFRα基因的突變

提示在部分野生型GIST中可能存在其他的發病機制，或少見位點的突變。

4 結論

①大多數的GIST存在c-kit基因的突變，無c-kit基因突變的GIST中有一部分存在PDGFRα基因的突變。②c-kit基因突變主要集中在第11號外顯子，其次為第9外顯子。突變的方式依次為缺失、點突變和串聯重復插入。PDGFRα基因的突變主要存在于CD117陰性的GIST。③結直腸以及胃腸道外及小腸GIST的總突變率較胃GIST為低；胃GIST的c-kit外顯子11突變率也較其他部位GIST高。

[參考文獻]

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（收稿日期：2013-06-13）