Caveolin—1和p42/p44MAPK在哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的作用

[摘要] 目的 觀察哮喘大鼠肺組織中Caveolin-1和p-p42/p44MAPK含量的變化，探討Caveolin-1和p42/p44MAPK在哮喘大鼠氣道平滑肌細(xì)胞增殖中的作用。 方法 2009年4月～2010年6月間選擇SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照組（C組）、哮喘組（A組）和地塞米松組（D組），每組8只。以卵白蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的方法復(fù)制大鼠慢性哮喘模型。觀察肺組織病理超微結(jié)構(gòu)變化，以圖像分析軟件測(cè)定支氣管壁厚度（wat/pbm）和支氣管平滑肌厚度（wam/pbm），免疫組化法檢測(cè)氣道平滑肌Caveolin-1、p-p42/p44MAPK蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 A組大鼠wat/pbm、wam/pbm大于C組（P < 0.01）；D組大鼠wat/pbm、wam/pbm小于A組（P < 0.01），大于C組（P < 0.01）；免疫組化法測(cè)定A組Caveolin-1表達(dá)量顯著低于C組（P < 0.01），D組表達(dá)高于A組（P < 0.01），但低于C組（P < 0.01）；A組p-p42/p44MAPK表達(dá)量顯著高于C組（P < 0.01），D組表達(dá)低于A組（P < 0.01），但高于C組（P < 0.05）；Caveolin-1表達(dá)與大鼠wam/pbm呈負(fù)相關(guān)（r = -0.894，P < 0.01）；p-p42/p44MAPK表達(dá)與大鼠wam/pbm呈正相關(guān)（r = 0.805，P < 0.01）；Caveolin-1與p-p42/p44MAPK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.941，P < 0.01）。 結(jié)論 Caveolin-1與p42/p44MAPK對(duì)哮喘大鼠氣道重塑有一定影響，其相互作用對(duì)哮喘大鼠的氣道平滑肌細(xì)胞增殖有調(diào)節(jié)作用。

[關(guān)鍵詞] 哮喘；大鼠，氣道重塑；Caveolin-1；p42/p44MAPK

[中圖分類號(hào)] R562.2+5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）25-0001-03

The role of caveolin-1 and p42/p44MAPK in the proliferation of airway smooth muscle cells in asthma

CHEN Huijun1 DAI Yuanrong2

1.Department of Respiratory Medicine， Jinhua Municipal Central Hospital of Zhejiang Province， Jinhua 321000， China； 2.Department of Respiratory Medicine， the Second Affiliated Hospital of Wenzhou Medical College， Wenzhou 325027， China

[Abstract] Objective To observe the changes of caveolin-1 and p-p42/p44MAPK in the lung tissue of asthmatic rats and to observe the effects of them in airway smooth muscle cells （ASMCs） proliferation. Methods Twenty-four healthy， male Sprague-Dawley rats from Apirl 2009 to June 2010 were randomly divided into three groups on average， including control group （group C）， asthmatic group （group A） and dexamethasone group（group D）. A rat chronic asthma model was exploited， in which rats were sensitized and provocated with ovalbumin. The histopathology and ultrastructure changes of pulmonary tissues were observed by light microscope. The total bronchial wall thickness （wat/pbm） and the bronchial smooth muscle thickness （wam/pbm） were measured with image-pro plus 6.0； The contents of caveolin-1 and p-p42/p44MAPK in the airway smooth muscle were detected by immunohistochemistry. Results Wat/pbm， wam/pbm of group A were significantly higher than those of group C （P < 0.01）， those of group D decreased than group A （P < 0.01）， nevertheless， higher than those of group C（P < 0.01）. Immunohistochemistry showed that the expression of caveolin-1 in group A significantly decreased compared with group C （P < 0.01）， that of group D was significantly elevated than that of group A （P < 0.01）， but decreased compared with group C （P < 0.01）. Immunohistochemistry showed that the expression of p-p42/p44MAPK in group A significantly increased compared with group C （P < 0.01）， that of group D was significantly decreased than that of group A （P < 0.01）， but still increased compared with group C （P < 0.05）. There were significantly negative correlation between wam/pbm and the expression of caveolin-1 detected by immunohistochemistry （r = -0.894， P < 0.01）. There were significantly positive correlation between wam/pbm and the expression of p-p42/p44MAPK detected by immunohistochemistry （r = 0.941， P < 0.01）. There were significantly negative correlation between the expression of caveolin-1 and p-p42/p44MAPK detected by immunohistochemistry （r = -0.805， P < 0.01）. Conclusion There may be some effects of caveolin-1 and p-p42/p44MAPK in airway remodeling in asthma rats， and the interreaction of them possibly plays a suppressive role in ASMCs proliferation.

[Key words] Asthma； Rat； Airway remodeling； Caveolin-1； p42/p44MAPK

氣道重塑是哮喘的重要病理特征。氣道平滑肌細(xì)胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）的增生和肥大在哮喘氣道重塑中發(fā)揮了重要的作用，已成為目前哮喘治療的新標(biāo)靶[1]。Caveolae最早于1950年發(fā)現(xiàn)于心臟內(nèi)皮，后在多數(shù)細(xì)胞類型和組織的質(zhì)膜中亦發(fā)現(xiàn)其存在。Caveolae常呈50～100 nm大小ω形，其形態(tài)依賴于細(xì)胞的生理狀態(tài)[2]。Caveolin-1是Caveolae的主要結(jié)構(gòu)蛋白，分為α、β兩個(gè)亞型，其中心疏水結(jié)構(gòu)域（102～134位殘基）構(gòu)成其跨膜結(jié)構(gòu)域，并通過N-末端膜附著結(jié)構(gòu)域和C-末端膜附著結(jié)構(gòu)域與膜結(jié)合。Caveolin-1在其C-末端134、144、157位有三個(gè)棕櫚酰化的半胱氨酸殘基，對(duì)Caveolin向細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)及與膽固醇的結(jié)合起重要作用[3]。Caveolin-1可以減少氣道平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、負(fù)性調(diào)節(jié)氣道平滑肌增殖[4]。p42/p44MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是體內(nèi)多條信號(hào)途徑的交點(diǎn)，在哮喘氣道發(fā)揮了重要作用[5]。Sathish等[6]發(fā)現(xiàn)Caveolin-1通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子等對(duì)氣道炎癥有重要作用。本研究通過復(fù)制大鼠哮喘氣道重塑模型，研究Caveolin-1、p42/p44MAPK的變化，并給予地塞米松干預(yù)，探討Caveolin-1、p42/p44MAPK對(duì)哮喘大鼠氣道重塑的影響，及其在哮喘ASMCs增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2009年4月～2010年6月間選擇SPF級(jí)雄性SD大鼠24只，4～6周齡，體重100～120 g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供；OVA（V級(jí)），購自美國Sigma公司；Caveolin-1兔抗大鼠多克隆抗體，購自杭州華安生物技術(shù)有限公司；phospho-p42/p44MAPK抗體，購自海門市碧云天生物技術(shù)研究所；兔SP檢測(cè)試劑盒、鼠SP檢測(cè)試劑盒，購自北京中杉生物技術(shù)有限公司；地塞米松磷酸鈉注射液，購自江蘇漣水制藥有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 哮喘大鼠氣道重塑模型復(fù)制 將24只健康雄性SD大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分為對(duì)照組（C組）、哮喘組（A組）和地塞米松組（D組），每組8只。參照Temelkovski等[7]及Palmans EJC等[8]的方法制備大鼠哮喘模型。對(duì)照組（C組）則代以生理鹽水致敏和激發(fā)大鼠；地塞米松組（D組）致敏階段同哮喘組，激發(fā)階段在每次激發(fā)前半小時(shí)予地塞米松0.5 mg/kg腹腔注射，同時(shí)其余各組激發(fā)前生理鹽水腹腔注射。末次激發(fā)后24 h內(nèi)取得肺組織標(biāo)本備用。

1.2.2 肺組織顯微結(jié)構(gòu)觀察及支氣管壁厚度和支氣管平滑肌厚度測(cè)定 HE染色法制作肺組織病理標(biāo)本，觀察各組肺組織結(jié)構(gòu)、炎性浸潤、支氣管壁有無增厚等情況。采用圖像分析軟件（Image-Pro Plus Version 6.0）分別測(cè)量支氣管基底膜周徑（pbm）、支氣管管壁總面積（wat）、支氣管平滑肌面積（wam）。并用pbm將測(cè)得的wat、wam標(biāo)準(zhǔn)化，以wat/pbm、wam/pbm分別代表管壁厚度和平滑肌厚度。

1.2.3 免疫組化法測(cè)定支氣管平滑肌Caveolin-1、p-p42/p44MAPK蛋白含量 肺組織石蠟包埋切片，脫蠟、水化，3%過氧化氫消除過氧化氫酶活性，微波修復(fù)抗原，胎山羊血清封閉，滴加一抗Caveolin-1兔抗大鼠多克隆抗體（1∶75稀釋）或p-p42/p44抗體（1∶50稀釋），4℃過夜，采用SP法，二氨基聯(lián)苯胺顯色，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片。PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。陽性表達(dá)呈棕黃色。每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)高倍鏡下支氣管切面（×400），以氣道平滑肌層為分析對(duì)象，應(yīng)用IPP6.0圖像分析軟件測(cè)定陽性部位的平均吸光度（mean optical density，MOD）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

全部數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示。多組樣本均數(shù)比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較方差齊者用LSD檢驗(yàn)，方差不齊者用Dunnett’T3檢驗(yàn)，兩變量的相關(guān)分析用Pearson直線相關(guān)分析法，取P < 0.05作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 肺組織顯微結(jié)構(gòu)改變

光鏡下見C組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)完整，支氣管上皮損害不明顯，支氣管及血管周圍未見明顯炎癥細(xì)胞浸潤，支氣管平滑肌未見明顯增厚。A組肺組織內(nèi)支氣管壁各層及肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜皺褶增多，支氣管上皮斷裂、脫落，管腔內(nèi)可見黏液栓形成、支氣管壁明顯增厚、支氣管平滑肌肥大、管腔狹窄等。D組支氣管少量炎性細(xì)胞浸潤，支氣管壁輕度增厚。

2.2 支氣管壁厚度和支氣管平滑肌厚度的比較

各組大鼠支氣管基底膜周徑（pbm）比較差異無顯著性（P > 0.05），提示所測(cè)支氣管壁厚度及平滑肌厚度有可比性。各組大鼠支氣管壁厚度及平滑肌厚度結(jié)果見表1。

2.3 免疫組化法測(cè)定支氣管平滑肌Caveolin-1、p-p42/p44MAPK蛋白含量

免疫組化結(jié)果顯示，Caveolin-1蛋白主要表達(dá)于胞膜，少部分表達(dá)于胞漿，呈棕黃色。C組Caveolin-1蛋白表達(dá)非常豐富，A組表達(dá)貧乏，明顯低于C組（P < 0.01）；D組Caveolin-1表達(dá)顯著高于A組（P < 0.01），但較C組表達(dá)減少（圖1～3，表2）。p-p42/p44MAPK蛋白主要表達(dá)于胞漿，C組大鼠氣道平滑肌層很少表達(dá)，A組大鼠氣道平滑肌細(xì)胞表達(dá)較為豐富，D組大鼠氣道平滑肌細(xì)胞可見表達(dá)，含量較A組降低（圖4～6，表2）。

2.4 相關(guān)性分析

Caveolin-1表達(dá)與wam/pbm呈負(fù)相關(guān)（r = -0.894，P < 0.01，n = 18）；p-p42/p44MAPK表達(dá)與wam/pbm呈正相關(guān)（r = 0.805，P < 0.01，n = 18）；Caveolin-1與p-p42/p44MAPK表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r = -0.941，P < 0.01，n = 18）。

3 討論

研究表明，氣道重塑是哮喘的重要病理特征，而氣道重塑通常包括ASMCs的增生和肥大兩種重要的病理變化，如何有效地控制ASMCs的增生和肥大，進(jìn)而防止甚至逆轉(zhuǎn)氣道重塑已成為近年來研究的熱點(diǎn)之一。目前，有研究發(fā)現(xiàn)Caveolin-1和p42/p44MAPK在氣道平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖調(diào)控中起著重要的作用，在ASMCs和其他內(nèi)臟的平滑肌細(xì)胞，Caveolin-1表達(dá)的缺失伴隨過度的增殖狀態(tài)，而肌細(xì)胞轉(zhuǎn)為不成熟的合成/分泌表型時(shí)Caveolin-1的表達(dá)是下降的，Caveolae和Caveolin-1作為增殖型和收縮型ASMCs的功能性反應(yīng)的決定子，是氣道重塑的重要因素[9]。siRNA敲除Caveolin-1可誘導(dǎo)ASMCs在無絲裂原刺激下增殖，揭示了Caveolae和Caveolin-1維持細(xì)胞靜止及其潛在的抗絲裂原作用[10]。Caveolin-1可以與多種信號(hào)分子結(jié)合，具有廣泛的抑制信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用[3]。本研究以卵白蛋白（OVA）致敏和激發(fā)的方法復(fù)制大鼠慢性哮喘模型，通過觀察A組肺組織內(nèi)支氣管壁各層及肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細(xì)胞浸潤，黏膜皺褶增多，支氣管上皮斷裂、脫落，管腔內(nèi)可見黏液栓形成、支氣管壁明顯增厚、支氣管平滑肌肥大、管腔狹窄等，顯示哮喘組大鼠氣道重塑、氣道平滑肌細(xì)胞增殖，表明模型復(fù)制成功。進(jìn)一步免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，Caveolin-1含量低于正常對(duì)照組，相關(guān)分析顯示Caveolin-1蛋白表達(dá)與wam/pbm呈負(fù)相關(guān)，提示Caveolin-1可能通過負(fù)性調(diào)節(jié)某些信號(hào)通路影響氣道平滑肌的表型轉(zhuǎn)換，從而抑制氣道重塑。

p42/p44MAPK信號(hào)通路即細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶（ERK1/2）可轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核并激活誘導(dǎo)增殖所需的轉(zhuǎn)錄因子。Jin-Hee Lee等[11]對(duì)人ASMCs進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)MEK特異性抑制劑U-0126阻滯了ERK活化和細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p-p42/p44MAPK在哮喘組ASMCs表達(dá)明顯高于對(duì)照組，其表達(dá)與氣道重塑指標(biāo)wam/pbm呈正相關(guān)，證實(shí)哮喘大鼠ASMCs中p42/p44MAPK活化增多，結(jié)果與白晶等[12，13]的實(shí)驗(yàn)研究相一致，提示ERK信號(hào)通路參與了慢性哮喘的氣道重塑過程。

Trifilieff等[14]發(fā)現(xiàn)地塞米松可以完全抑制哮喘小鼠的炎癥反應(yīng)和氣道高反應(yīng)性，并部分影響氣道重塑過程，激素對(duì)減少氣道重塑有效。本實(shí)驗(yàn)以地塞米松組作為哮喘治療對(duì)照組，發(fā)現(xiàn)地塞米松亦能影響大鼠氣道平滑肌內(nèi)Caveolin-1和p-p42/p44MAPK的表達(dá)，但表達(dá)量處于正常對(duì)照組及哮喘組之間，進(jìn)一步證實(shí)了地塞米松對(duì)氣道重塑的抑制作用，并與Caveolin-1和p42/p44MAPK信號(hào)通路有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Caveolin-1和p42/p44MAPK的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈顯著負(fù)相關(guān)，而兩者分別與氣道重塑指標(biāo)wam/pbm呈負(fù)性及正性相關(guān)，這些結(jié)果顯示，Caveolin-1可能抑制了p42/p44MAPK的活化，兩者在哮喘大鼠氣道重塑中可能存在一定的內(nèi)在聯(lián)系。Gosens等[10]通過人ASMCs培養(yǎng)，利用β-環(huán)糊精破壞Caveolae結(jié)構(gòu)和siRNA敲除Caveolin-1均導(dǎo)致了自發(fā)的p42/p44MAPK活化。Engelman等[15]也進(jìn)行了相關(guān)的研究，進(jìn)一步證實(shí)兩者的聯(lián)系，而兩者之間的作用是間接的[16]。

綜上所述，Caveolin-1與p42/p44MAPK對(duì)哮喘大鼠氣道重塑有一定影響，Caveolin-1可能抑制氣道重塑，p42/p44MAPK通路的活化可能促進(jìn)氣道重塑，兩者在哮喘的氣道重塑過程中存在著一定的聯(lián)系，其相互作用對(duì)哮喘大鼠的氣道平滑肌細(xì)胞增殖有調(diào)節(jié)作用。有待于進(jìn)一步后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究其作用機(jī)制。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Camoretti-Mercado B. Targeting the airway smooth muscle for asthma treatment[J]. Transl Res，2009，154（4）：165-174.

[2]Thomas CM，Smart EJ. Caveolae structure and function[J]. J Cell Mol Med，2008，12（3）：796-809.

[3]王騰科，朱毅. Caveolae及其蛋白組學(xué)進(jìn)展[J]. 生理科學(xué)進(jìn)展，2005， 36（4）：357-360.

[4]Chen CM，Wu MY，Chou HC，et al. Downregulation of caveolin-1 in a murine model of acute allergic airway disease[J]. Pediatr Neonatol，2011，52：5-10.

[5]管小俊，張維溪，蘇苗賞，等. ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在哮喘大鼠氣道重塑中作用的初步探討[J]. 中國免疫學(xué)雜志，2007，23：1026-1030.

[6]Sathish V，Abcejo AJ，VanOosten SK，et al. Caveolin-1 in cytokine-induced enhancement of intracellular Ca2+ in human airway smooth muscle[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2011，301（4）：607-614.

[7]Temelkovski J，Hogan SP，Shepherd DP，et al. An improved murine model of asthma： selective airway inflammation， epithelial lesions and increased methacholine responsiveness following chronic exposure to aerosolised allergen[J]. Thorax，1998，53（10）：849-856.

[8]Palmans E，Kips JC，Pauwels RA. Prolonged allergen exposure induces structural airway changes in sensitized rats[J]. Am J Respir Crit Care Med，2000，161（2 Pt 1）：627-635.

[9]Halayko AJ，Tran T，Gosens R. Phenotype and functional plasticity of airway smooth muscle： role of caveolae and caveolins[J]. Proc Am Thorac Soc，2008，5（1）：80-88.

[10]Gosens R，Stelmack GL，Dueck G，et al. Role of caveolin-1 in p42/p44 MAP kinase activation and proliferation of human airway smooth muscle[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2006，291（3）：523-534.

[11]Lee JH，Johnson PR，Roth M，et al. ERK activation and mitogenesis in human airway smooth muscle cells[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280（5）：1019-1029.

[12]白晶，劉先勝，徐永健，等. ERK信號(hào)通道調(diào)控大鼠氣道平滑肌細(xì)胞的增殖和凋亡[J]. 中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào)，2007，23（1）：38-44.

[13]白晶，劉先勝，徐永健，等. ERK在慢性哮喘大鼠氣道平滑肌增殖中的作用[J]. 中國病理生理雜志，2008，24（3）：417-422.

[14]Trifilieff A，El-Hashim A，Bertrand C. Time course of inflammatory and remodeling events in a murine model of asthma： effect of steroid treatment[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2000，279（6）：1120-1128.

[15]Engelman JA，Chu C，Lin A，et al. Caveolin-mediated regulation of signaling along the p42/44 MAP kinase cascade in vivo. A role for the caveolin-scaffolding domain[J]. FEBS Lett，1998，428（30：205-211.

（收稿日期：2013-04-26）