臍帶間充質干細胞無血清培養的實驗研究

[摘要] 目的 建立一種簡單的體外無血清培養擴增人臍帶間充質干細胞（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs）的方法。 方法 利用酶消化法分離hUCMSCs，在無血清干細胞培養體系下培養擴增，進行形態學觀察，CCK-8法分析細胞生長曲線，流式細胞儀分析細胞表面抗原表達及細胞周期，進行成骨、成脂誘導分化。 結果 hUCMSCs呈典型的成纖維細胞形態，具有較強的增殖能力。CD29、CD44、CD90、CD105均呈陽性表達，而CD34、CD45呈陰性表達。3周可誘導分化為脂肪細胞和成骨細胞。 結論 利用酶消化法和無血清的培養體系能夠快速分離培養出大量hUCMSCs，該方法擴增得到的間充質細胞具備穩定的細胞標記物和生長狀態，可用于各種治療的臨床試驗。

[關鍵詞] 間充質干細胞；臍帶；無血清培養液；細胞培養

[中圖分類號] R446.11 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）27-0085-03

hUCMSCs因來源豐富、體外擴增能力強、免疫原性低、無倫理問題等受到干細胞研究者的重視。無血清培養基因組分較明確，減少了異種血清臨床應用的潛在危險。本實驗應用無血清培養體系分離培養hUCMSCs，解決其臨床應用的生物安全性問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

間充質干細胞無血清條件培養基（杭州百通）、0.25%胰酶（吉諾生物），Ⅰ型膠原酶（Sigma），anti-CD29、anti-CD45、anti-CD90、anti-CD105 （BD Biosciences），anti-CD34（Santa Cruz Biotechnology），anti-CD44（Abcam），細胞周期即時檢測試劑盒（凱基生物），成骨及成脂誘導分化培養液、茜素紅、油紅O （Cyagen）。臍帶取自剖腹產足月胎兒，由解放軍117醫院婦產科提供，產婦及家屬對實驗均知情同意，并經醫院倫理委員會批準。

1.2 實驗方法

1.2.1 hUCMSCs的分離培養及傳代 無菌PBS漂洗新生兒臍帶，剪成3 cm的小段，剝離血管，用PBS洗滌干凈，剪碎后放入離心管中。加入10 mL 0.2%Ⅰ型膠原酶及5 mL PBS置于37℃孵箱中消化過夜。加入10 mL 0.25%胰酶-0.02%EDTA，37℃消化45min后，200目濾網過濾掉較大團塊，用PBS充分稀釋，反復混勻后分裝入離心管中，室溫3 000 rmp離心20 min。棄上清，加入適量培養基混勻。細胞計數，接種密度為106個/cm2，置于37℃、飽和濕度、5%CO2孵箱中培養。3～5 d后換液，洗去懸浮的組織和細胞。待細胞生長至80%融合時，PBS清洗2次，加入1 mL預熱的0.05%胰酶，待顯微鏡下細胞變圓后，用舊培養液終止消化，輕輕吹打，吸取細胞懸液于離心管中，室溫300 g離心10 min。收集細胞，并計數，以5×103/cm2的接種密度進行傳代。

1.2.2 CCK-8法檢測細胞活性 取生長狀態良好的第3代細胞，調整細胞濃度至2×107/L加入96孔板，每孔100 μL，放在37℃、5% CO2的培養箱中培養，7d內在特定時間點，取出96孔細胞培養板每孔分別加入10 μL CCK-8溶液，繼續孵育1 h。用酶標儀（波長450 nm）測定各孔吸光度值（OD值），以OD值代表細胞的相對數量，繪制細胞生長曲線。

1.2.3 流式細胞儀檢測細胞周期 取對數生長期的細胞，常規消化，1500r/min離心5min，取細胞懸液100 μL（含有2×105個細胞）。加入200 μL預冷乙醇固定，室溫孵育10 min，加入RnaseA 200 μL，盡量避免產生氣泡，室溫孵育10 min，加入碘化丙啶300 μL，室溫避光孵育15 min，上機檢測。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞表面抗原 取生長狀態良好的細胞，消化并計數，以每管含1×106個細胞，分別加入10 μL單克隆抗體CD29、CD34、CD44、CD45、CD90及CD105，同型對照10 μL作為陰性對照，室溫避光孵育30 min，PBS洗滌2次，室溫300 g離心5 min，PBS重懸后，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 成脂、成骨誘導分化 待第3代細胞達80%融合，常規消化，以5×104/孔密度接種于6孔培養板（成骨誘導培養皿底部包被明膠），常規培養，待細胞達80%融合時，成脂、成骨誘導組分別加入2 mL成脂、成骨誘導分化液，對照組加入等量基礎培養液，一周換液2～3次，倒置顯微鏡下觀察細胞形態與生長情況，3周后分別進行油紅O、茜素紅染色。

2 結果

2.1細胞基本生物學特征

酶消化法獲得的細胞4d后有大量細胞貼壁，部分細胞伸出偽足，形態不一，見封三圖4A。經過約8d培養后細胞匯合成片，呈均一的成纖維細胞形態。傳代后細胞較快貼壁伸展，增殖較快，培養3d細胞可達80%融合，見封三圖4B。CCK-8法檢測細胞生長曲線呈S型，細胞接種后1～2 d為適應期，第2～5天為快速增長期，隨后進入平臺期，符合正常細胞的生長特性，見圖1。

2.2 細胞生長周期

流式細胞儀檢測結果顯示，第3代hUCMSCs中G0/G1期細胞為78.87%，G2期細胞為3.96%，S期細胞為5.46%，見圖2。

2.3 hUCMSCs表面標記物的表達

流式細胞儀檢測結果顯示，細胞CD29、CD44、CD90、CD105陽性率分別為99.9%、96.4%、98.5%、94.1%，而CD34、CD45陽性率分別為0.262%、0.125%，驗證此細胞為間充質干細胞，而非造血干細胞來源，純度較高，見圖3。

2.4 成脂、成骨誘導分化鑒定

成脂誘導組細胞形態逐漸由梭形變為圓形，3周后有成串的脂滴形成，油紅O染色后呈現橙紅色，見封三圖5A。成骨誘導組細胞外基質分泌逐漸增多，3周后運用茜素紅進行鈣化結節染色，可見大量橘紅色致密結節形成，見封三圖5B。對照組染色均未見陽性結果。

3 討論

目前基礎與臨床研究中應用的間充質干細胞主要來源于成人骨髓，但在衰老和疾病情況下其數量和擴增、分化能力顯著下降，取材過程會給患者帶來創傷，面臨醫學倫理學的困擾，使其在臨床應用受到一定限制。臍帶是孕婦與胎兒之間的物質交通支，是分娩后的廢棄物，來源豐富，收集臍帶對產婦和胎兒均不造成傷害。與骨髓MSCs相比，hUCMSCs增殖潛能、活性更高，免疫原性相對較低[1]。Ma等[2]研究發現人臍帶沃頓膠中的MSCs不表達移植物抗宿主病相關的抗原MHC-II，在免疫抑制治療方面具有積極的臨床應用前景[3]，有望代替骨髓干細胞成為一種新的MSCs來源。

已有多篇文獻報道成功分離培養UCMSCs[4]，但培養體系中加入了一定比例的血清如胎牛血清、臍血血清、正常人的AB血清等。血清含豐富的營養成分、細胞因子、微量元素以及貼壁因子等，有利于細胞的生長。添加胎牛血清的培養基被認為是體外擴增MSCs最有效的培養基。但是，血清中的成分尚不明確，可能攜帶病原體、異種蛋白抗原，在生產臨床級別的細胞產品時，理論上會導致病原體的傳播及臨床排斥反應。基于能夠提供應用于臨床的MSCs為目標，本實驗選擇了無血清的MSCs專用培養基培養體系，避免以往使用任何人與動物血清培養體系，為MSCs臨床應用安全性、有效性的標準化提供有益的依據。

目前分離hUCMSCs主要有組織塊貼壁法[5]及酶消化法[6]兩種。前一種方法費時較長，很難徹底分離臍帶組織中的干細胞，傳代后純化時間長，很難短時間內獲得大量種子細胞滿足臨床細胞移植的需要。采用膠原酶消化法可快速獲得大量貼壁生長的原代細胞，操作簡便易行，凍存復蘇后免疫表型無顯著變化，保持較好的細胞活力[7]。吳偉等[8]利用化學成分明確的無血清培養基在體外培養擴增骨髓MSCs，可以維持干細胞特性，用于細胞治療以及生物醫學研究。方彥艷等[9]利用無血清的人MSCs專用培養基培養體系，臍帶組織培養法能夠分離培養出大量MSCs，避免了培養中異種蛋白的混入而降低臨床排異反應。

應用該培養體系，hUCMSCs傳代后3d就可達到80%～90%融合，CCK-8法檢測細胞增殖率發現，細胞體外擴增和自我更新能力很強。流式細胞術分析顯示無血清培養條件下78%細胞處于細胞周期的G0/G1期，符合干細胞的慢周期特性。體外培養的細胞經流式細胞儀檢測均一性好，CD29、CD44、CD90、CD105均呈強陽性表達，但不表達CD34（造血前體細胞表面標志） 和CD45（白細胞抗原），證明此細胞非造血干細胞來源。經成骨、成脂誘導液體外培養后，hUCMSCs具有良好的成骨、成脂分化能力。細胞貼壁能力很強，呈漩渦狀的集落形態特征，具有強大的增殖能力。以上特征與Bruyn等[10]報道的結果一致，符合國際細胞治療委員會規定的間充質干細胞的三條鑒定標準。研究表明，應用無血清培養基體系酶消化法可快速獲得足夠應用于臨床治療級細胞數量，為下一步體外定向誘導hUCMSCs向肝樣細胞分化，為肝組織工程提供種子細胞來源。

[參考文獻]

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[10] Bruyn CD，Najar M，Raicevic G，et al. A rapid，simple，and reproducible method for the isolation of mesenchymal stromal cells from Wharton’s jelly without enzymatic treatment[J]. Stem Cells Dev，2011，20（3）：547-557.

（收稿日期：2013-07-25）