miR—19影響人乳腺癌MCF7細胞增殖、遷移及侵襲的研究

[摘要] 目的 探討miR-19對人乳腺癌MCF7細胞增殖、遷移及侵襲的影響。 方法 體外培養人乳腺癌MCF7細胞，分別轉染pre-miR-19和miR-19抑制物，然后應用臺盼藍法檢測MCF7細胞活性和增殖情況，應用transwell小室法測定MCF7細胞遷移和侵襲能力改變。 結果 pre-miR-19轉染組的MCF7細胞生長抑制率下降，細胞活性和增殖能力增強，細胞遷移侵襲能力增強；miR-19抑制物轉染組的MCF7細胞生長抑制率增高，細胞活性和增殖能力下降，細胞遷移侵襲能力減弱。 結論 在乳腺癌的發生發展過程中，miR-19發揮原癌基因作用，促進乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲。

[關鍵詞] 人乳腺癌；miR-19；增殖；遷移

[中圖分類號] R730 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）30-0040-02

乳腺癌是女性常見惡性腫瘤之一，近年來我國乳腺癌發病呈上升趨勢[1]。研究發現，乳腺癌患者的多種基因表達異常，其中包括多種非蛋白編碼微小RNA（micro RNA，miR）基因異常。miR基因的表達產物為miR分子，由18～25個核苷酸組成。miR基因參與細胞增殖和分化、細胞凋亡、胚胎發育等重要生命過程，對一些疾病的發生起重要調節作用[2]。有報道稱，乳腺癌患者的miR-17-92家族中的多種基因表達異常。miR-19基因是該家族基因的一個重要成員。關于miR-19基因與乳腺癌發病的作用，國內目前報道較少。本文探討miR-19基因對人乳腺癌MCF7細胞株增殖、遷移以及侵襲的影響，為miR-19參與乳腺癌發病的分子機制理解，為miR-19作為乳腺癌早期診斷及預后預測指標提供實驗依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞與試劑

人乳腺癌細胞株MCF7購自南方醫科大學。DMEM培養液購自賽默飛世爾生物化學制品公司。miR反轉錄試劑盒和RNA提取試劑盒購自北京艾德萊生物公司。脂質體Lipofectamine 2000和MTT試劑盒購自碧云天公司。Transwell侵襲小室購自美國Costar 公司。

1.2 實時熒光定量PCR

設計miR-19基因擴增引物，委托上海生物工程有限公司合成。上游引物P1：5’-GCAGTCCTCTGTTAGTTTTGC-3’，下游引物P2：5’-GCAGGCCACCATCAGTTTT-3’。按照RNA提取試劑盒說明書提取細胞總RNA。以細胞總RNA為模板，應用miR反轉錄試劑盒進行實時熒光定量PCR。反應條件：94℃變性2 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個循環；72℃，5 min。

1.3細胞培養及轉染

細胞采用DMEM，37℃，5% CO2培養。將4×105～8×105/mL 的MCF7細胞接種于12孔板，加含10%小牛血清的DMEM培養基，5% CO2，37℃培養，待細胞生長至70%～80%融合度，按說明書進行轉染。A組（空白組）轉染脂質體，B組（miR-19組）轉染pre-miR-19，C組（miR-19抑制組）轉染miR-19抑制物。轉染后繼續培養4 h，向每孔加入含10%小牛血清的DMEM，于48 h收集細胞備用。利用RT-PCR檢測各組細胞miR-19含量，使用U6B作為內參基因，分析miR-19表達水平，計算公式為△Ct=Ct（miR-19）-Ct（U6B）。實驗重復3次。

1.4臺盼藍染色法檢測細胞生長抑制率

取轉染48 h的細胞，胰酶消化后加入0.4%臺盼藍溶液，顯微鏡觀察細胞染色情況。死細胞被染成明顯藍色，而活細胞拒染呈無色透明狀，分別計數活細胞和死細胞數，計算生長抑制率。生長抑制率（%）= 死細胞總數/（活細胞總數+死細胞總數）×100%。實驗重復3次。

1.5 細胞活性和增殖試驗

取轉染48 h的細胞，采用MTT法檢測細胞活力，應用酶標儀測定490 nm波長處吸收值，與活細胞數量呈正比。實驗重復3次。

1.6細胞遷移及侵襲實驗

細胞遷移實驗：轉染48 h后的待測細胞胰酶消化后，用無血清培養基調整濃度為2×105/mL，將細胞加入到Transwell上室中，下室加入含10%小牛血清的DMEM培養液，培養24 h，取出小室內薄膜，甲醇固定，Giemsa染色，移至載玻片上，干燥后樹脂封片，顯微鏡觀察，計算細胞遷移率。細胞侵襲實驗：預先在Transwell上室底部加入稀釋樹膠，37℃溫育其干燥，再加入待測細胞，后續操作同細胞遷移實驗，計算細胞侵襲率。實驗重復3次。

1.7 統計學處理

應用SPSS15.0軟件進行統計分析，計量資料以（x±s）表示，組間比較采用方差分析，P < 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

三組細胞分別轉染脂質體、pre-miR-19和miR-19抑制物，48 h后進行各項指標檢測，結果見表1。miR-19表達量結果顯示：B組細胞miR-19表達量高于A組，C組低于A組，提示MCF7細胞轉染pre-miR-19和miR-19抑制物后，細胞miR-19基因表達量分別上調和減少。細胞生長情況結果顯示：B組細胞生長抑制率低于A組（P < 0.05），C組高于A組（P < 0.05），提示miR-19 促進MCF7細胞生長；增殖活力結果顯示，B組細胞miR-19過表達促進了MCF7細胞增殖（P < 0.05），C組細胞miR-19低表達抑制MCF7細胞增殖（P < 0.05），提示miR-19 促進MCF7細胞增殖活力。細胞遷移及侵襲能力檢測結果表明：B組細胞miR-19過表達促進MCF7細胞遷移和侵襲（P < 0.05），提示miR-19能夠促進MCF7細胞遷移和侵襲。

表1 三組細胞miR-19表達量、生長情況、遷移及侵襲能力（x±s）

3 討論

乳腺癌是嚴重危害女性健康的常見惡性腫瘤之一。乳腺癌發生發展與多種基因表達異常有關，主要包括原癌基因的激活和抑癌基因的失活。乳腺癌相關的原癌基因有CerbB2、Notch1等基因[3，4]，其表達產物具有促癌作用。此類原癌基因表達上調能夠促進乳腺癌復發、侵襲轉移等生物事件。乳腺癌相關的抑癌基因有P27基因等，其表達產物具有抑癌作用。P27基因表達下調會導致乳腺癌細胞增殖活性增加，促進乳腺癌發生及發展[5]。

miR基因的表達產物是一類內源性非蛋白質編碼的小RNA分子，通過與目標mRNA 配對，調節靶基因的表達，參與生物體發育、炎癥發生、腫瘤發生及進展等生理、病理過程。miR基因的作用靶點可以是抑癌基因，也可為癌基因，既而發揮促癌或抑癌作用。近年研究證實，乳腺癌患者miR基因表達異常，其中miR-21、miR-155等基因表達上調[6，7]， Let-7、miR-145等基因表達下調[8，9]。

本文觀察到，MCF7細胞轉染pre-miR-19分子后，導致細胞miR-19基因過表達，引起MCF7細胞增殖活力增強，細胞遷移和侵襲能力也增強。反之，MCF7細胞轉染miR-19抑制物后，導致細胞miR-19基因低表達，造成MCF7細胞增殖活力減弱，但是細胞遷移和侵襲能力未受到明顯影響。本文認為，可能與細胞轉染miR-19抑制物的劑量有關。本文研究結果提示，miR-19在乳腺癌的發生發展過程中起著正向調控作用，發揮原癌基因功能， miR-19分子能夠促進乳腺癌細胞增殖、遷移以及侵襲。

miR-19參與乳腺癌發生發展的機制尚不十分明確，國外有學者報道，miR-19通過抑制PTEN來促進乳腺癌細胞的增殖、侵襲和轉移[7]。也有研究指出，miR-19可能通過上調NF-κB表達，從而促進乳腺癌細胞的增殖[10]，在今后的工作中，miR-19在乳腺癌發生發展中的作用機制有待深入研究。

[參考文獻]

[1] 劉芳，曹德明，劉堅，等. 乳腺癌患者生活質量現況調查及影響因素分析[J]. 中國現代醫生，2013，51（13）：8-10.

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[5] 劉鏡文，魏茂富，邱小靈. P27 在乳腺癌及正常乳腺組織中的表達及其意義[J]. 中國現代醫生，2012，50（26）：92-93.

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[8] 曲杰，王勝林. miR let-7b 抑制乳腺癌MCF7細胞遷移及其機制[J].江蘇大學學報（醫學版），2012，22（4）：328-331.

[9] 王穎懿，房林. miR-145、miR-375在乳腺浸潤性導管癌中的表達及臨床意義[J]. 同濟大學學報（醫學版），2012，33（3）：54-57.

[10] Michael P，Gantier H，James Stunden，et al. A miR-19 regulon that controls NF-κB signaling[J]. Nucleic Acids Research，2012，40（16）：8048-8058.

（收稿日期：2013-08-14）