10種中藥對產ESBLs大腸埃希菌的體外抑菌活性

[摘要] 目的 測定烏梅等10味中藥對產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌的體外抑菌活性，明確其最低抑菌濃度（MIC），為臨床應用中藥治療產ESBLs大腸埃希菌感染提供參考依據。 方法 各收集10株產ESBLs和非產ESBLs大腸埃希菌，制備適當濃度的各種中藥煎液備用。采用瓊脂稀釋法進行定量抑菌試驗，分別測定和比較各種中藥的MIC值。對抑菌作用明顯的中藥進行產ESBLs和非產ESBLs大腸埃希菌MIC比較。 結果 中藥烏梅、五倍子、黃連、黃芩、黃柏、穿心蓮、魚腥草、重樓、金銀花、連翹對產ESBLs大腸埃希菌的MIC值分別為（17.19±4.94）mg/mL、（18.75±6.59）mg/mL、（37.50±10.21）mg/mL、（46.20±15.10）mg/mL、（450±105.41）mg/mL、（475±79.06）mg/mL、（237.50±39.53）mg/mL、（118.75±59.29）mg/mL、（425±88.19）mg/mL、（225±52.70）mg/mL，其中烏梅、五倍子、黃連、黃芩的MIC均值分別為17.19 mg/mL、18.75 mg/mL、37.50 mg/mL、46.20 mg/mL，有較好的抑菌效果。烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產ESBLs和非產ESBLs大腸埃希菌MIC值經統計學處理，P > 0.05。 結論 10味中藥對產ESBLs大腸埃希菌株均有不同程度的體外抑菌活性。其中烏梅和五倍子效果最強，其次是黃連、黃芩，其余的中藥抑菌活性較弱。

[關鍵詞] 中藥；大腸埃希菌；超廣譜β-內酰胺酶；藥物敏感試驗

[中圖分類號] R285.5 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）31-0065-03

眾所周知，大腸埃希菌是醫院內感染常見的病原菌，隨著抗生素的廣泛使用，細菌的耐藥性問題也趨于嚴重[1]。有報道稱產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）大腸埃希菌已占臨床分離到的大腸埃希菌60.1%[2]。因此，探尋新的不同于抗生素的抗菌藥物對于改善產ESBLs大腸埃希菌感染性疾病的治療現狀具有重要意義。近年來許多研究表明中藥具有抑菌的生物活性[3-6]。本文旨在研究烏梅等10味中藥對產ESBLs大腸埃希菌的體外抑菌活性，為臨床應用中藥治療耐藥菌感染提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株

產ESBLs和非產ESBLs大腸埃希菌均來源于新余市中醫院門診和住院患者的臨床標本。分離培養按照《全國臨床檢驗操作規程》第3版[7]進行，鑒定和藥敏使用合肥恒星細菌鑒定和藥敏分析儀。ESBLs的確證實驗采用臨床和實驗室標準化研究所（CLSI）推薦的雙紙片相鄰試驗（協同法）[8]。各收集至少10株經過確認的產ESBLs大腸埃希菌和非產ESBLs大腸埃希菌保存-20℃冰箱中備用。

1.2 標準菌株

大腸埃希菌ATCC25922，由溫州康泰公司提供。

1.3 中藥煎液的制備

十種中藥烏梅、黃連、黃芩、黃柏、五倍子、穿心蓮、重樓、金銀花、魚腥草、連翹均取自新余市中醫院中藥房。以烏梅為例。將100 g烏梅置于燒瓶中，加入5～8倍體積的蒸餾水，浸泡30 min，加熱待其沸騰后調節火力大小使其微沸30 min，過濾將濾液倒入燒杯中。然后往燒杯中加入約3～5倍體積蒸餾水，加熱煮沸，微沸30 min，過濾。合并兩次濾液，并進行減壓蒸餾，使藥液體積達100 mL，即得到中藥的水提濃縮液，濃度為1 000 mg/mL。滅菌后儲存在-20℃冰箱中備用。

1.4 菌懸液的制備

挑取經過活化和純培養18～24 h的菌落，用生理鹽水調成0.5麥氏比濁單位（含菌量1.5×108 CFU/mL），再1∶10稀釋，使其含菌量為1.5×107 CFU/mL，備用。

1.5 MIC測定

采用CLSI推薦的瓊脂稀釋法。

1.5.1 含藥平板制備 取三角燒瓶10只，分別加入融化的MH瓊脂25 mL，在第一只加入100%（1∶1）的中藥煎液25 mL，使其濃度為500 mg/mL，混勻后取出25 mL，加入第二只燒瓶中，再混勻后取出25 mL加入第三只燒瓶中，依此類推，直到最終濃度為0.98 mg/mL，高壓滅菌后傾倒平板待用。

1.5.2 瓊脂稀釋法 用上述配好的含藥MH瓊脂平板（含藥量分別為500、250、125、62.50、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95 mg/mL）進行實驗。用微量移液器吸取1 μL含菌量為1.5×107 CFU/mL的菌懸液接種平板，最終接種菌量約每個接種點為104個菌。待菌液干后將平板倒置放35℃溫箱培養18～24 h后觀察結果，以肉眼觀察無細菌生長的最低藥物濃度為MIC。

經過實驗，將對產ESBLs大腸埃希菌抑菌效果較明顯的中藥篩選出來，再對這些中藥進行非產ESBLs大腸埃希菌的抑菌實驗，記錄MIC值。

1.6 統計學處理

使用SPSS13.0統計學軟件分析處理，數據比較采用t檢驗，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

對產ESBLs大腸埃希菌抑菌效果較明顯的是烏梅、五倍子、黃連、黃芩等4味中藥，具體結果見表1、表2。

從表1可以看出，在較低含量藥物水平下，依然對產ESBLs大腸埃希菌抑菌效果較明顯的中藥是烏梅、五倍子、黃連、黃芩。從表2可以看出，烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產ESBLs大腸埃希菌MIC值在（15.63～62.50） mg/mL之間，平均MIC值分別為（17.19±4.94） mg/mL、（18.75±6.59） mg/mL、（37.50±10.21） mg/mL、（46.20±15.10） mg/mL，MIC90值分別是15.63 mg/mL、15.63 mg/mL、31.25 mg/mL、31.25 mg/mL。穿心蓮、魚腥草、黃柏、重樓、金銀花、連翹等6味中藥對產ESBLs大腸埃希菌也有一定的抑菌作用，但只有在較高濃度時才能抑制產ESBLs大腸埃希菌的生長。烏梅、五倍子、黃連、黃芩4味中藥的MIC90值遠低于穿心蓮等6味中藥的MIC90值，兩者比較有顯著性差異（t = 3.45，P < 0.05）。

烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產ESBLs大腸埃希菌和非產酶大腸埃希菌的MIC值經統計學處理，無顯著性差異（P > 0.05），結果見表3。

3 討論

近年來，大腸埃希菌多重耐藥株的大量出現，使臨床對大腸埃希菌引起的感染治療越來越困難，幾乎到了無藥可用的地步。ESBLs是指質粒介導的能賦予細菌對多類β-內酰胺類抗生素耐藥的一類酶。由于質粒可在菌株間轉移和傳播，同時該酶有較廣的水解底物譜，且部分產ESBLs菌株不但對β-內酰胺類抗生素耐藥，而且還對氨基糖苷類、喹諾酮類等藥物耐藥，因此給臨床抗感染治療帶來很大困難[9]。

國內外對于中藥抗大腸埃希菌的報道較多，對產ESBLs大腸埃希菌株的中藥研究較少。周雪寧等[10]對五倍子進行了體外抗產ESBLs大腸埃希菌的研究，并與清熱解毒類的黃芩、黃連進行對比。結果顯示，三種中藥單味水煎劑對20株產ESBLs大腸埃希菌均有不同程度的抑菌作用，抑菌作用經方差檢驗有顯著性差異，以五倍子效果最好。欒耀芳等[11]對黃芩等8種中藥水煎劑采用瓊脂稀釋法，以臨床收集的產ESBLs大腸埃希菌為實驗組，同時以非產酶大腸埃希菌為對照組進行體外敏感性研究，觀察各藥物的最低殺菌濃度。結果顯示黃芩對產酶大腸埃希菌的抗菌作用最好，黃連、大青葉次之，兩組結果經統計學處理，差異無統計學意義。

我們用烏梅等10種中藥對來自于臨床的10株產ESBLs大腸埃希菌株進行體外抗菌活性篩選，結果發現這10種中藥均有不同程度的抑菌活性，穿心蓮、魚腥草、黃柏、重樓、金銀花、連翹只有在較高濃度時才能抑制產ESBLs大腸埃希菌的生長，而烏梅、五倍子、黃連、黃芩在較低濃度時就有抑菌作用。尤其是烏梅和五倍子水煎劑在低濃度時對產ESBLs大腸埃希菌的抑制作用最明顯，是極具開發價值的抗產ESBLs大腸埃希菌的中藥。

從烏梅、五倍子、黃連、黃芩對產ESBLs大腸埃希菌和非產酶大腸埃希菌的MIC值的比較可以看出，兩組結果無顯著性差異（P > 0.05）。中藥對產酶和非產酶大腸埃希菌株的體外抑菌活性并無差異，說明中藥的抗菌機制與抗生素存在不同。許多中藥中不含酰胺環或成分復雜，ESBLs對其沒有水解作用；中藥中含有的一些特殊成分如五倍子中的鞣酸、黃連中的小檗堿等能抑制和干擾細菌的代謝；另外中藥調節及提高機體免疫力的功能也在抗菌機制中起了相當重要的作用[12]。除此之外，關于中藥的抑菌機制還有許多問題需要我們進一步研究探討。

[參考文獻]

[1] 蔣敦松，龍泉. 大腸埃希菌感染的臨床分布與耐藥性分析[J]. 海南醫學，2010，22（5）：120-121.

[2] 李海峰，李靜玫，趙基深，等. 醫院連續9年病原菌分布及耐藥性分析[J]. 中華醫院感染學雜志，2010，22（6）：29-30.

[3] 劉璐，陳靜，陳麗杰. 黃芩、五倍子、黃連體外抑菌活性的研究[J]. 中國中醫藥科技，2011，18（5）：424-424.

[4] 李乃謙. 3種中藥對金黃色葡萄球菌體外抑菌作用的比較[J]. 中國中醫藥咨訊，2011，3（7）：198-198.

[5] 李娟，李曉東，楊麗霞，等. 單味中藥體外抑菌活性的研究進展[J]. 中國實驗方劑學雜志，2011，17（11）：283-286.

[6] 黃美玲，湛學軍，許仕紅，等. 五倍子等3種中藥對女性生殖道厭氧菌感染的抗菌活性研究[J]. 實驗與檢驗醫學，2011，29（2）：127-128.

[7] 葉應嫵，王毓三，申子瑜. 全國臨床檢驗操作規程[M]. 第3版. 南京：東南大學出版社，2006：744-745.

[8] 陳東科，孫長貴. 實用臨床微生物學檢驗與圖譜[M]. 北京：人民衛生出版社，2011：145-146.

[9] 閻愛榮，廖暉. 中藥對產ESBLs大腸埃希菌的作用研究進展[J]. 中國藥房，2012，23（7）：668-669.

[10] 周雪寧，權志博，王雷. 五倍子等三種中藥體外抗產ESBLs大腸埃希菌研究及其探討[J]. 陜西中醫學院學報，2009，32（5）：80-81.

[11] 欒耀芳，張鳳花，吳國英. 黃芩等8種中藥對產β-內酰胺酶大腸埃希菌的敏感性研究[J]. 山東中醫雜志，2005，24（10）：629-631.

[12] 杭永付，薛曉燕，方蕓，等. 中藥抗菌和逆轉耐藥作用機制研究進展[J]. 中國藥房，2011，22（47）：4504-4507.

（收稿日期：2013-07-15）