免疫組化質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化管理

[摘要] 探討免疫組化室內(nèi)質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化管理，根據(jù)本科室免疫組化質(zhì)量控制管理實(shí)際，從實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中、實(shí)驗(yàn)后三方面闡述免疫組化質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)化管理細(xì)則，總結(jié)在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的經(jīng)驗(yàn)和體會(huì)，提高免疫組化檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性。

[關(guān)鍵詞] 免疫組化；質(zhì)量控制；標(biāo)準(zhǔn)化管理

[中圖分類號(hào)] R446.8 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] C [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）31-0134-03

免疫組化染色技術(shù)在現(xiàn)代病理診斷中的應(yīng)用日益廣泛， 對(duì)各類腫瘤的確診及鑒別診斷具有重要意義，而且在腫瘤患者個(gè)體化治療、靶向治療方案的選擇及預(yù)后判斷方面越來(lái)越受到臨床醫(yī)生的青睞，已經(jīng)成為病理診斷中不可或缺的輔助手段[1]。因而很多單位，包括基層醫(yī)院也開展了這個(gè)項(xiàng)目。隨之而來(lái)的是，免疫組化質(zhì)量控制問(wèn)題也凸顯出來(lái)了。這其中有實(shí)驗(yàn)員操作不當(dāng)?shù)囊蛩兀灿衅渌囊蛩兀缃M織固定不好、試劑效價(jià)和試劑盒質(zhì)量問(wèn)題等等，各免疫組化實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理水平參差不齊[2，3]。目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化管理的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，因而在眾多繁雜的條件中，探索找到一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的免疫組化質(zhì)量控制的條件，即所謂的標(biāo)準(zhǔn)化管理方法具有重要意義。筆者根據(jù)本科室的實(shí)際情況，總結(jié)免疫組化室內(nèi)質(zhì)控管理的一點(diǎn)心得體會(huì)，從實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中、實(shí)驗(yàn)后三方面淺談免疫組化室內(nèi)質(zhì)量控制如何實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化管理。

1實(shí)驗(yàn)前的標(biāo)準(zhǔn)化管理

1.1 組織處理的標(biāo)準(zhǔn)化

組織處理得當(dāng)是成功制片的關(guān)鍵，對(duì)免疫組化染色結(jié)果的影響尤其重要，主要包括取材、固定、脫水等環(huán)節(jié)。如果組織處理不良，那么在其后的任何階段均難以補(bǔ)救。組織或細(xì)胞固定的目的是使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)凝固，終止或減少外源性或內(nèi)源性酶的反應(yīng)，防止細(xì)胞自溶，以保持組織細(xì)胞的固有形態(tài)和結(jié)構(gòu)，更重要的是保存組織或細(xì)胞的抗原性，防止抗原的丟失或彌散。因此，標(biāo)本應(yīng)盡可能保持新鮮并及時(shí)進(jìn)行固定。我們科室積極與臨床一線溝通，宣傳固定的意義、方法和要求，擬定以下標(biāo)準(zhǔn)：手術(shù)標(biāo)本離體后30分鐘內(nèi)，用10%中性緩沖福爾馬林固定。固定時(shí)間為小標(biāo)本6～12 h，大標(biāo)本12～24 h。組織取材厚度為3～4 mm，放入全自動(dòng)脫水機(jī)進(jìn)行脫水[4]。組織處理不好對(duì)抗原修復(fù)也產(chǎn)生影響，熱修復(fù)時(shí)脫片的概率將會(huì)增大。

1.2 免疫組化切片的標(biāo)準(zhǔn)化

1.2.1 玻片處理及切片厚度 用于免疫組化的玻片一般都需要進(jìn)行防脫片涂膠處理，目前常用的有氨丙基三乙氧基硅烷和L-多聚賴氨酸，防脫片的效果對(duì)比其他粘附劑都要好[5]。我們采用的是L-多聚賴氨酸，效果很好。采用3～4 μm連續(xù)切片[6]，切片厚度不能過(guò)于求薄，太薄由于抗原的減少，會(huì)導(dǎo)致抗體陽(yáng)性表達(dá)的減弱，也不宜太厚，太厚在熱修復(fù)過(guò)程中容易導(dǎo)致脫片。

1.2.2 抗原修復(fù)方法 福爾馬林固定組織導(dǎo)致組織中抗原決定簇封閉，也就是組織細(xì)胞經(jīng)福爾馬林固定后，導(dǎo)致抗原決定簇的三維結(jié)構(gòu)發(fā)生異常改變，使抗原決定簇被掩蓋或原來(lái)位于表面的一些抗原決定簇因折疊而形成隱蔽的抗原決定簇，因此抗原的理化性質(zhì)發(fā)生了顯著的變化，表位空間結(jié)構(gòu)改變導(dǎo)致許多抗原免疫活性丟失。但這一變化是可逆的，可通過(guò)抗原修復(fù)。目前抗原修復(fù)有兩種方法：酶消化法和熱修復(fù)法。

抗原修復(fù)方法的選擇關(guān)系到組織抗原能否暴露充分，這對(duì)免疫組化染色結(jié)果有很大影響。有很多文獻(xiàn)比較了各種抗原修復(fù)方法的優(yōu)劣，目前，被認(rèn)為效果最好、最常用的修復(fù)方式為高壓加熱修復(fù)[7-9]。我們將微波加熱與高壓加熱的方法進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性定位于細(xì)胞核的抗體，如P53、Ki-67等的核表達(dá)，在高壓修復(fù)后明顯強(qiáng)于微波修復(fù)，因此我們選擇高壓加熱修復(fù)，抗原修復(fù)液為檸檬酸鹽，修復(fù)時(shí)間為高壓鍋出氣后2 min自然冷卻，時(shí)間過(guò)短，抗原暴露不夠，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，導(dǎo)致背景過(guò)深。

1.2.3 抗原修復(fù)液的選擇 加熱抗原修復(fù)緩沖液有多種如檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）、Tris（pH7～8）、EDTA（pH8.0）等，目前首選檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0），優(yōu)點(diǎn)是染色背景清晰， 適合于大多數(shù)抗體。Tris和EDTA兩種修復(fù)液對(duì)部分抗原修復(fù)效果較強(qiáng)，但其染色背景同時(shí)加深，如使用不當(dāng)易造成假陽(yáng)性結(jié)果。值得注意的是，沒(méi)有一種抗原修復(fù)液能適合于所有的抗體，檸檬酸鹽緩沖液（pH6.0）可作為免疫組化常規(guī)使用的抗原修復(fù)緩沖液，但也不能除外某些抗體適于用EDTA和Tris緩沖修復(fù)液。一般抗原比較難于表達(dá)的抗體多選擇后兩者。

1.3 試劑管理的標(biāo)準(zhǔn)化

1.3.1 試劑清單及使用記錄的管理 試劑的種類、公司有很多，為了方便管理，我們創(chuàng)建了一個(gè)“免疫組化試劑登記表”Excel電子表格，進(jìn)行試劑清單的管理，簡(jiǎn)潔又規(guī)范（圖1）。登記表的內(nèi)容包括抗體名稱、類型、稀釋度、是否修復(fù)、克隆號(hào)、編號(hào)、批號(hào)、公司名稱、庫(kù)存量、有效期、接收日期、啟用日期、用完日期等，也可以根據(jù)各單位實(shí)際情況自己添加內(nèi)容。所有試劑應(yīng)保證在有效期內(nèi)使用，只有這樣才能確保抗體的效價(jià)。因此，登記表中有效期、用完日期的記錄要求完整準(zhǔn)確，過(guò)期試劑或者失效試劑應(yīng)丟棄不用，并備注原因。每種試劑的使用情況都要記錄在案（圖2），與圖1表格建立超鏈接。下圖1為本科室免疫組化試劑登記表部分的截圖，利用Excel條件格式將不同字體顏色顯示不同指代意義，如紅色提示超過(guò)有效期等。

圖1 免疫組化試劑登記表（部分）

圖2 試劑盒使用記錄表（圖1中超鏈接）

1.3.2 冰箱溫度控制及試劑的擺放 所有的試劑均應(yīng)在試劑公司建議的溫度下保存，儲(chǔ)存試劑的冰箱應(yīng)每天檢查，建立一個(gè)冷藏冰箱溫度監(jiān)測(cè)表，并按時(shí)記錄溫度值。不管是濃縮型還是即用型試劑，如果是一堆地放在冰箱里，要用或配置的時(shí)候找起來(lái)比較麻煩費(fèi)事，我們自己設(shè)計(jì)制做了幾個(gè)試劑擺放的木架子，將免疫組化試劑按首字母A→Z排列，同系列的按數(shù)字從小到大依次排列，如Actin、AFP、Bcl-2、CA125、CD10、CD117等依次排列（如圖3所示），這樣找試劑比原來(lái)方便許多，節(jié)省時(shí)間，看起來(lái)也比較整潔。

圖3 試劑的擺放

圖4 陽(yáng)性與陰性對(duì)照

1.3.3試劑配置 免疫組化的試劑分為即用型和濃縮型兩種，濃縮試劑的配置，需要對(duì)抗體滴度（稀釋比）進(jìn)行評(píng)估。我們參考公司推薦的抗體滴度，在其前后各增加一個(gè)實(shí)驗(yàn)滴度，如公司推薦1∶200，我們配置1∶100、1∶200、1∶400三種滴度，進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，以觀察陽(yáng)性細(xì)胞染色強(qiáng)度及非特異性染色，驗(yàn)證試劑的可靠滴度，然后才能在常規(guī)的實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用。

2實(shí)驗(yàn)中的標(biāo)準(zhǔn)化管理

2.1 檢測(cè)方法的選擇

免疫組化的檢測(cè)方法有很多種，大致分為生物素型和非生物素型兩大類。因組織中含有內(nèi)源性生物素，所以會(huì)干擾免疫組化的染色結(jié)果，在生物素型檢測(cè)方法的操作過(guò)程中，要阻斷內(nèi)源性生物素干擾。非生物素型聚合物檢測(cè)，可以有效地防止內(nèi)源性生物素的影響，并且靈敏度高，操作簡(jiǎn)便，為很多實(shí)驗(yàn)室采用，是目前免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化染色的首選方法。我們采用的是非生物素型EliVision二步法，檢測(cè)方法比較穩(wěn)定，效果也好。

2.2 免疫組化染色操作標(biāo)準(zhǔn)化

目前，免疫組化染色分手工操作和全自動(dòng)免疫組化儀操作。在手工染色過(guò)程中，或多或少要受到實(shí)驗(yàn)員個(gè)人因素的干擾。全自動(dòng)免疫組化儀的出現(xiàn)，避免了操作過(guò)程中人為因素的干擾，增加了染色結(jié)果的可靠性，有助于免疫組化質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)化管理。我們采用全自動(dòng)免疫組化儀進(jìn)行染色，與手工染色相比，具有以下技術(shù)優(yōu)勢(shì)：①精確的抗體孵育時(shí)間控制，確保染色質(zhì)量，避免背景非特異性著色。②精確的抗體濃度以及量的控制，避免因?qū)嶒?yàn)員手法不同而導(dǎo)致抗體濃度被稀釋，影響染色強(qiáng)度的表達(dá)，還可以避免交叉污染和非特異性染色的產(chǎn)生。③二維碼的識(shí)別，可以使滴加試劑的時(shí)候不會(huì)產(chǎn)生滴錯(cuò)的現(xiàn)象，避免人工滴加錯(cuò)誤，導(dǎo)致假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)生。④可根據(jù)實(shí)驗(yàn)員的工作需要，統(tǒng)籌安排，能更加合理高效地利用時(shí)間。⑤程序結(jié)束后可以保存整個(gè)進(jìn)程，如果出現(xiàn)問(wèn)題，可以在實(shí)驗(yàn)結(jié)束后復(fù)審，以便查找出問(wèn)題的原因[10]。

2.3 陽(yáng)性與陰性對(duì)照

每一次免疫組化染色必須嚴(yán)格設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照[11]。我們的方法是，每個(gè)抗體都備有一個(gè)陽(yáng)性對(duì)照的小蠟塊，陽(yáng)性對(duì)照小蠟塊的準(zhǔn)備：取材的同時(shí)，從大體標(biāo)本中重新取材，制作成大小約為0.4 cm×0.3 cm×0.3 cm的組織塊，一起脫水包埋。時(shí)間應(yīng)控制在48 h之內(nèi)，用以保存組織抗原；常規(guī)HE切片染色，鏡下觀察有癌組織后，進(jìn)行所需抗體表達(dá)測(cè)定，評(píng)估適合作為陽(yáng)性對(duì)照后放置備用。陽(yáng)性對(duì)照小蠟塊主要目的針對(duì)試劑的不同批次、重新配置、滴度預(yù)試驗(yàn)等，用來(lái)評(píng)估試劑的可靠度。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將待測(cè)組織與陽(yáng)性對(duì)照小蠟塊組織裱于同一張切片（圖4），PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，然后進(jìn)行染色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更可靠、更節(jié)約成本，這一方法值得推廣應(yīng)用。

3實(shí)驗(yàn)后的標(biāo)準(zhǔn)化管理

3.1 染色結(jié)果判斷的標(biāo)準(zhǔn)化

免疫組化切片應(yīng)是陽(yáng)性標(biāo)記強(qiáng)而非特異性染色淡或無(wú)，兩者形成鮮明的對(duì)比，陽(yáng)性表達(dá)必須在細(xì)胞或組織特定的部位，細(xì)胞邊界清楚；每批染色都要有陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和自身對(duì)照才能對(duì)染色結(jié)果作出正確判斷。判斷標(biāo)準(zhǔn)常根據(jù)陽(yáng)性細(xì)胞的百分比或陽(yáng)性細(xì)胞的染色深度來(lái)判斷，其顏色深淺反映抗原量的多少。免疫組化染色結(jié)果還要結(jié)合組織形態(tài)學(xué)判斷是真正的陽(yáng)性染色而非其他著色。陽(yáng)性反應(yīng)分布總是有規(guī)律、局限、定位準(zhǔn)確和一定形態(tài)特征的，如細(xì)胞膜著色呈圓形；典型的細(xì)胞核著色為均質(zhì)狀，核仁和染色質(zhì)呈顆粒狀著色。細(xì)胞漿呈顆粒狀（位于細(xì)胞器）或纖維狀（中間絲或微絲）或彌漫片狀（細(xì)胞內(nèi)液、病毒顆粒及吸收蛋白）著色；細(xì)胞間質(zhì)呈纖維條塊狀著色；若陽(yáng)性結(jié)果定位異常象征著疾病過(guò)程。非特異性著色為無(wú)規(guī)律、無(wú)界線、定位不準(zhǔn)確且不能重復(fù)；結(jié)締組織受染和內(nèi)源性生物素干擾是最常見的非特異性著色，鏡下為均勻細(xì)顆粒狀的淺棕色，但不會(huì)出現(xiàn)在細(xì)胞膜或細(xì)胞核。

由于免疫組化染色結(jié)果是定性指標(biāo)，不能定量，染色結(jié)果判斷受到診斷醫(yī)師的主觀因素影響而導(dǎo)致結(jié)果差異。為了減少這種差異的發(fā)生，我們科室內(nèi)部采用統(tǒng)一的免疫組化染色結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)格按照公認(rèn)的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定，如乳腺癌ER、PR采用Bessley分級(jí)法[12]，C-erbB-2采用美國(guó)臨床腫瘤協(xié)會(huì)（ASCO）/美國(guó)病理學(xué)家學(xué)院（CAP）HER2檢測(cè)指南等[13]。

3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果的跟蹤、記錄

每批次的免疫組化結(jié)果，進(jìn)行質(zhì)量跟蹤記錄，對(duì)于特別異常的結(jié)果，應(yīng)該分析原因。是新購(gòu)試劑，還是新配試劑，或者是操作過(guò)程中有無(wú)異常；全自動(dòng)免疫組化儀染色的可以把程序調(diào)出來(lái)復(fù)審，然后備注分析的原因，重新設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照再染色，觀察效果，直到問(wèn)題解決為止。對(duì)于一些單位來(lái)說(shuō)，配置的濃縮試劑，在經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后，也要進(jìn)行陽(yáng)性強(qiáng)度的評(píng)測(cè)，以防止配置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)后效價(jià)的降低，導(dǎo)致陽(yáng)性強(qiáng)度的減弱。

3.3 試劑的庫(kù)存管理

實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，需要在“免疫組化試劑登記表”中，對(duì)于使用的試劑進(jìn)行數(shù)據(jù)的更新，以便及時(shí)更換采購(gòu)試劑。

3.4 實(shí)驗(yàn)室的清潔、整理

清潔工作場(chǎng)所內(nèi)的臟污，必要的東西分門別類以一定的順序放置，保持工作場(chǎng)所干凈、整潔。對(duì)于使用過(guò)的儀器，做好儀器的日常維護(hù)，記錄使用情況。另外，實(shí)驗(yàn)室的衛(wèi)生對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員也有一定的安全保護(hù)作用。

4 討論

免疫組化質(zhì)量的好壞影響的因素方方面面。要確保免疫組化結(jié)果的可靠性和穩(wěn)定性，加強(qiáng)免疫組化室內(nèi)質(zhì)量控制管理，制定相應(yīng)質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)尤其重要。筆者結(jié)合本科室的實(shí)際情況，對(duì)實(shí)驗(yàn)前、實(shí)驗(yàn)中和實(shí)驗(yàn)后三個(gè)層面可能影響免疫組化染色結(jié)果的因素進(jìn)行分析、總結(jié)，制定本科室免疫組化室內(nèi)質(zhì)控管理相關(guān)細(xì)則，在日常工作實(shí)踐中得到檢驗(yàn)。我們發(fā)現(xiàn)，標(biāo)本及時(shí)用10%中性福爾馬林固定，取材大小適當(dāng)，組織良好的脫水，切片的厚度適宜并做防脫片處理，選擇高壓熱修復(fù)，抗體效價(jià)的評(píng)估，采用全自動(dòng)免疫組化儀代替手工操作，并做陽(yáng)性與陰性對(duì)照，依照公認(rèn)的免疫組化判斷標(biāo)準(zhǔn)等因素，是一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的免疫組化室內(nèi)質(zhì)量控制的條件。各個(gè)環(huán)節(jié)制定相應(yīng)的質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)，以達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)化管理目標(biāo)。另外每個(gè)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)建有本實(shí)驗(yàn)室免疫組化檢測(cè)的SOP文件，所謂的SOP是指 Standard Operation Procedure三個(gè)單詞中首字母的大寫，即標(biāo)準(zhǔn)作業(yè)程序，就是將某一事件的標(biāo)準(zhǔn)操作步驟和要求以統(tǒng)一的格式描述出來(lái)，用來(lái)指導(dǎo)和規(guī)范日常的工作。定期做好實(shí)驗(yàn)室室內(nèi)質(zhì)量控制，真正把SOP文件應(yīng)用到實(shí)際工作中去。每一個(gè)實(shí)驗(yàn)人員在進(jìn)行免疫組化操作的時(shí)候，也應(yīng)該有嚴(yán)肅的態(tài)度和高度的責(zé)任心，才能在制片過(guò)程中做到一絲不茍，才能做出優(yōu)秀的切片。制度化、規(guī)范化操作是實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作的前提條件[14，15]，全自動(dòng)免疫組化儀器的使用是必要手段，陽(yáng)性和陰性對(duì)照的設(shè)立是結(jié)果可信的可靠保證，穩(wěn)定良好的染色質(zhì)量和可靠的結(jié)果判讀才是免疫組化質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)化管理的最終目的。

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（收稿日期：2013-06-21）