抗癲一號對癲癇大鼠自由基代謝及海馬神經(jīng)元的影響

[摘要] 目的 探討抗癲一號對慢性致癇大鼠自由基含量及海馬神經(jīng)元的影響。 方法 腹腔注射戊四唑（PTZ）造成慢性癲癇大鼠動物模型，化學比色法測定其自由基含量，HE染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)元變化。 結(jié)果 抗癲一號可減少癲癇大鼠血清內(nèi)自由基含量，與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P < 0.01）；可增加海馬區(qū)神經(jīng)元的數(shù)目，恢復神經(jīng)元形態(tài)及結(jié)構(gòu)。 結(jié)論 抗癲一號通過增加抗氧化酶活性來阻止PTZ點燃后所產(chǎn)生的自由基對神經(jīng)元的損害，從而起到神經(jīng)保護作用。

[關(guān)鍵詞] 抗癲一號；癲癇；戊四唑；自由基；神經(jīng)元

[中圖分類號] R742.1 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）11-0020-02

癲癇是以腦部神經(jīng)元異常過度放電所致的突然、反復和短暫的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能失常為特征的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其發(fā)病機制復雜。隨著近年來自由基與癲癇腦損傷之間關(guān)系的研究逐漸深入，自由基在癲癇中的作用越來越受到重視。抗癲一號由石菖蒲、郁金、柴胡等中藥組成，具有豁痰熄風、活血開竅、補腎疏肝、寧心益智的功效。本實驗擬采用抗癲一號治療戊四唑誘導大鼠癲癇模型，觀察其對癲癇大鼠自由基及神經(jīng)元損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠，體重180～220 g，雌雄各半，中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供（許可證號：SCXK-（軍）2007-005）。

1.1.2 藥品 抗癲一號由沈陽市第六人民醫(yī)院提供，含10.12 g生藥/g，批號：101018；苯妥英鈉片，東北制藥總廠生產(chǎn)，批號：200909102；癲癇寧片，昆明中藥廠有限公司生產(chǎn)，批號：100610。

1.1.3 主要試劑與儀器 戊四唑（PTZ），美國Sigma公司；多聚甲醛，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號：F20091203；烏來糖，國藥集團化學試劑有限公司生產(chǎn)，批號：T20090811；超氧化物歧化酶（SOD）測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20110112；丙二醛（MDA）測試盒，南京建成生物工程研究所生產(chǎn)，批號：20110114；UV-2450紫外可見分光光度計，日本島津公司；ELX800酶標儀，美國BioTek公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 PTZ大鼠點燃模型 取體重180～220 g Wistar大鼠150只，雌雄各半，隔日腹腔注射以生理鹽水新鮮配制的濃度為1%的PTZ溶液，即為40 mg/kg的亞驚厥劑量，并在注射PTZ后觀察動物的行為變化，記錄發(fā)作潛伏期、發(fā)作分級和發(fā)作持續(xù)時間。發(fā)作分級按照Racine′s[1]的6級分級法：0級：無驚厥；1級：點頭或頭部抽搐；2級：全身肌陣攣；3級：頭部抽搐加前肢陣攣；4級：陣攣驚厥加后肢站立；5級：跌倒；6級：全身強直-陣攣驚厥。連續(xù)觀察28 d，凡連續(xù)5次出現(xiàn)2級或以上記錄的大鼠，即為點燃模型大鼠。停藥1周后，再次用同樣方法測試，如仍保持在2級以上發(fā)作，則視為點燃成功。

1.2.2 分組及給藥 取模型成功大鼠，分為6組，每組16只，雌雄各半，另取16只大鼠為空白對照組；模型對照組（兩組分別給予等體積的蒸餾水）；抗癲一號低劑量組（8.11 g生藥/kg）、中劑量組（16.22 g生藥/kg）、高劑量組（32.44 g生藥/kg）；癲癇寧片組（1.705 g/kg）；苯妥英鈉片組（0.027 g/kg），給藥容積為10 mL/kg，每日1次，連續(xù)給藥30 d。

1.2.3 對癲癇大鼠血清中SOD、MDA含量的影響 每組取8只大鼠，雌雄各半，采用化學比色法測定大鼠血清中SOD 活性及MDA 含量，操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.2.4 對癲癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的影響 各組取8只大鼠，雌雄各半，麻醉后，開胸暴露心臟，0.9%生理鹽水灌注沖洗后灌注4%多聚甲醛，見四肢強直后斷頭取出腦組織，置于4%的多聚甲醛中固定24 h，脫水，石蠟包埋，HE染色觀察癲癇大鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

計量資料以數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件包進行檢驗分析。均數(shù)±標準差表示，評價整體性差異，組間均數(shù)采用One-Way ANOVA方法分析，并結(jié)合LSD分析方法進行組間比較。P < 0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結(jié)果

2.1 抗癲一號對PTZ癲癇大鼠模型血清中SOD、MDA含量影響

藥物干預組可降低癲癇大鼠血清中MDA含量，增加SOD含量，與模型組相比差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05或P <0.01）。見表1。

2.2 抗癲一號對PTZ癲癇大鼠模型海馬神經(jīng)元形態(tài)學的影響

鏡下可見PTZ癲癇大鼠模型海馬神經(jīng)元數(shù)量減少，結(jié)構(gòu)改變，且細胞層次紊亂，細胞核固縮、染色質(zhì)著色不均勻，組織間水腫，有大量炎性細胞浸潤；各給藥組可見海馬神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)、形態(tài)有所恢復，與模型組比較，細胞數(shù)目增加、大小較均勻、形態(tài)結(jié)構(gòu)較清晰，核固縮變形和組織水腫現(xiàn)象有所減輕，偶見散在的炎性細胞，見圖1。

3 討論

本實驗結(jié)果表明，PTZ點燃癲癇大鼠模型可產(chǎn)生大量自由基，抗癲一號具有潛在的抗氧化作用，降低MDA含量，增加SOD水平；且可抑制由自由基產(chǎn)生所帶來的海馬神經(jīng)元的損傷。

有研究表明，癲癇發(fā)作可使體內(nèi)自由基增多，并損害周圍組織。因此，學者們假設(shè)可清除癲癇發(fā)病過程中自由基的物質(zhì)將成為具有神經(jīng)保護作用的新型抗癲癇藥物，無獨有偶，近期的大量實驗數(shù)據(jù)也恰恰證明了具有抗氧化作用的物質(zhì)在治療癲癇方面的有效性[2]。Frantaeva[3]等對杏仁核點燃大鼠癲癇發(fā)作后自由基產(chǎn)生情況及其對神經(jīng)元的損害研究中發(fā)現(xiàn)，自發(fā)點燃大鼠模型的海馬區(qū)自由基產(chǎn)生增加，神經(jīng)元細胞減少，給予抗氧化產(chǎn)物（維生素E及谷胱甘肽）則可抑制自由基的產(chǎn)生及海馬區(qū)神經(jīng)元細胞的死亡；Ilhan等研究發(fā)現(xiàn)[4，5]，抗氧化劑可顯著抑制癲癇大鼠的發(fā)作，減少自由基的產(chǎn)生。這些數(shù)據(jù)均提示自由基參與了癲癇發(fā)作及其病理過程。此外，電生理學研究也證明了通過短暫性增加興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，同時減少抑制性神經(jīng)遞質(zhì)可促使大鼠海馬、紋狀體的自由基-過氧化氫復合物的超興奮性。

在大量的癲癇動物模型中，PTZ點燃后可產(chǎn)生一系列的生物化學過程，包括細胞膜磷脂酶，蛋白酶和核酸酶的激活。最明顯的改變是細胞膜磷脂酶的代謝可導致游離脂肪酸、甘油二酯、類花生酸、脂類過氧化物及自由基的釋放[6-7]。生理情況下，受到自由基損害的組織可通過抗氧化系統(tǒng)進行防御。SOD為重要的抗氧化酶之一，與自由基發(fā)生反應后可阻止組織損害。MDA則由自由基攻擊所產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化物分解的終產(chǎn)物。我們的實驗結(jié)果支持PTZ點燃癲癇發(fā)作的同時伴隨自由基增多的假設(shè)。本實驗中，模型組SOD活性降低，MDA含量增加。由此可推測抗氧化酶活性的改變可增加脂質(zhì)過氧化物。抗癲一號則可降低MDA含量，增加SOD活性，與文獻結(jié)論一致[8，9]。這些結(jié)果提示抗癲一號通過增加抗氧化酶活性來阻止PTZ點燃后所產(chǎn)生的自由基對組織的損害。

癲癇發(fā)作時腦內(nèi)的自由基含量增加，而增加的自由基通過促使蛋白功能喪失，干預細胞氧化還原反應后的細胞周期循環(huán)等多方面作用，最終導致神經(jīng)元死亡，死亡的神經(jīng)元可再次增加腦內(nèi)自由基的含量，由此形成惡性循環(huán)。因此抑制自由基的產(chǎn)生可減少神經(jīng)元的死亡，反之，增加神經(jīng)元的生存率亦可減少自由基對腦內(nèi)組織的損害。研究表明，腦內(nèi)海馬區(qū)與意識及控制反饋有關(guān)[10]，并對產(chǎn)生的自由基特別敏感，所以可用來進行癲癇發(fā)作時神經(jīng)元損傷狀況的觀察。本研究結(jié)果表明，抗癲一號可增加海馬區(qū)神經(jīng)元細胞數(shù)量，恢復神經(jīng)元形態(tài)及結(jié)構(gòu)，減輕核固縮及水腫，充分證實了抗癲一號在阻止PTZ點燃后產(chǎn)生的自由基損害上神經(jīng)保護的角色。

綜上所述，阻止癲癇發(fā)作期間自由基的產(chǎn)生可成為治療癲癇的另一靶目標，且對癲癇病人給予抗氧化治療具有重要意義。當然，抗氧化劑治療的臨床研究更是十分必要的。

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（收稿日期：2013-02-20）