硫酸鋅誘導金屬硫蛋白減輕再灌注肺細胞凋亡的實驗研究

[摘要] 目的 探究硫酸鋅誘導金屬硫蛋白對再灌注肺細胞凋亡的影響。 方法 選取健康的雄性SD大鼠30只隨機分為對照組、標準組和實驗組，觀察三組不同處理后的基本情況。 結果 標準組中的超氧化物歧化酶活性（95.7±25.7） U/mL，明顯低于對照組（152.4±24.5） U/mL和實驗組（138.5±15.8） U/mL，標準組的丙二醛含量（8.8±1.7） nmol/mL、髓過氧化物酶的活性（25.6±1.7） NU/mL明顯高于對照組和實驗組。標準組的金屬硫蛋白含量（0.089±0.023） ng/mg明顯低于對照組的（0.154±0.042）ng/mg和實驗組的（0.263±0.06） ng/mg。標準組的肺細胞凋亡指數明顯高于對照組和實驗組。 結論 硫酸鋅誘導金屬硫蛋白通過減輕脂質過氧化反應和中性粒細胞聚集，從而改善肺組織超微結構的異常情況，并有效減輕再灌注肺細胞的凋亡。

[關鍵詞] 硫酸鋅；金屬硫蛋白；再灌注；細胞凋亡

[中圖分類號] R363 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）12-0003-03

臨床中再灌注損傷的原因比較多，而且其具體的作用機制尚未明確。隨著臨床中不斷的研究，發現金屬硫蛋白是一種普遍存在于各種生物體中的多功能誘導蛋白，而且在不同病理的作用下，金屬硫蛋白的含量也會發生明顯的變化。臨床中大量的研究表明，金屬硫蛋白對再灌注損傷具有一定的保護作用[1]。因此，為了進一步了解金屬硫蛋白與再灌注肺細胞凋亡之間的聯系，本文對硫酸鋅誘導金屬硫蛋白對再灌注肺細胞凋亡的影響進行深入探究，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物與分組

選取健康雄性SD大鼠，共計30只，均由溫州醫學院實驗動物中心所提供，體重為210～270 g，平均（235.5±5.8） g，且均為清潔級。并采取隨機數字表法分為對照組、標準組和實驗組，每組均為10只，且三組大鼠的年齡和體重以及飼養方法等比較無明顯的差異（P > 0.05）。

1.2 儀器與試劑

儀器：RM2135型切片機、H-7500型透射電鏡。試劑：丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）均由南京建成公司提供，In Situ Cell Death Detection Kit由瑞士Roche公司提供，BCA蛋白濃度測定試劑盒和大鼠MT ELISA試劑盒均由上海西唐生物科技有限公司提供。

1.3 模型制備

首先，將選取的大鼠進行腹腔注射5.0%的水合氯醛進行麻醉，并將其固定在鼠臺上。然后在頸部正中進行切開，并進行有效的分離氣管和右側頸動脈，緊接著給予氣管切開和插管處理，并給予動物呼吸機進行通氣。其次，沿著大鼠的左胸骨進行切斷第3和第4以及第5肋骨，并打開取胸腔，并游離于左肺門，進行穿過阻斷帶處理。對照組10只大鼠在左肺門游離后，進行留置阻斷帶，并進行觀察150 min；而標準組在阻斷左肺門后，進行觀察30 min，并再次開放再灌注120 min；而實驗組的10只大鼠在術前24 h給予注射3.6% ZnSO4（1.5 mL/kg），然后在阻斷左肺門之后，進行觀察30 min，并再次開放再灌注120 min。

1.4 金屬硫蛋白測定

在進行模型制備實驗之后，選取大鼠左肺組織并制成10.0%的組織漿，然后采取BCA法測定組織中的總蛋白含量，并采取雙抗體夾心ABC-ELISA法測定組織漿中的金屬硫蛋白含量，肺組織中金屬硫蛋白濃度為組織漿中的金屬硫蛋白含量占總蛋白含量的比[2]。

1.5 血清指標測定

在進行模型制備實驗之后，抽取大鼠頸動脈血液2 mL，并進行離心處理，3 000 r/min，離心10 min。然后依據試劑盒的說明書進行規范性操作，并測定血清中的丙二醛（MDA）、髓過氧化物酶（MPO）和超氧化物歧化酶（SOD）含量[3]。

1.6 肺組織細胞凋亡測定

肺組織細胞凋亡的測定主要采取原位缺口末端標記法進行測定[4]，將每組大鼠進行肺組織石蠟切片處理，并選取1張，然后進行脫蠟-水化處理。然后，①給予蛋白酶K進行處理20 min，溫度為37℃；②加入TUNEL restion mixture 50 μL/片，并溫度控制為37℃，反應時間為1 h；③加入Conver-POD，溫度為37℃，反應時間為30 min；④采取二氨基聯苯胺（DAB）進行顯色處理；⑤進行蘇木素復染處理；⑥高倍鏡下選取5個不同的高倍視野（×400）觀察。凋亡指數=凋亡細胞數/觀察細胞總數×100%。

1.7 電鏡觀察方法

選取大鼠左肺門旁的組織，大小為1.0 mm×1.0 mm×1.0 mm。并給予2.5%戊二醛進行前固定，給予1.0%的餓酸進行后固定處理，并給予梯度乙醇丙酮進行脫水處理，并進行Epon812包埋處理，進行超薄切片，同時，采取醋酸硝酸鉛進行雙重染色，并在H-7500型透射電鏡下進行觀察。

1.8 統計學處理

2 結果

2.1 金屬硫蛋白含量

2.3 肺組織超微結構觀察

通過對三組大鼠的肺組織超微結構觀察分析，對照組大鼠的毛細血管和肺泡Ⅰ型和Ⅱ型的上皮結構均正常；標準組大鼠的毛細血管內出現有炎癥細胞，而且肺泡腔中出現有大量的滲出，其巨噬細胞也比較活躍。Ⅰ型肺泡上皮細胞吞飲小泡均減少，而Ⅱ型肺泡上皮細胞胞質出現水腫，且核膜增粗和擴張，板層小體減少，顏色也由原來的深變淡；實驗組大鼠的毛細血管內皮細胞水腫并不明顯，而且線粒體的染色也較深，Ⅰ型肺泡上皮細胞吞飲小泡也較多，而Ⅱ型肺泡上皮細胞表面的微絨毛也輕度減少，且核固縮現象也不明顯，肺泡隔基本上處于正常水平。

2.4 相關因素和肺組織細胞凋亡指數分析

3 討論

再灌注損傷在臨床中比較常見，目前對于發病的機制并未完全了解。但通過對其分析，發現該病的發生與氧自由基的損傷和細胞的凋亡以及細胞內的鈣超載損傷等因素有關[5]。而且資料顯示，金屬硫蛋白能夠有效地調節金屬離子的代謝，并具有對重金屬解毒的功能，從而清除氧自由基的抗氧化功能，起到抗細胞凋亡的效果[6]。

通過本次臨床研究分析，術前給予硫酸鋅可誘導金屬硫蛋白，并減輕脂質過氧化的反應和中性粒細胞的聚集，從而改善肺組織超微結構的異常情況，并有效減輕對再灌注肺細胞的凋亡[7，8]。本組資料顯示，標準組的肺組織中金屬硫蛋白含量明顯低于對照組和實驗組的肺組織中金屬硫蛋白含量，差異有統計學意義。由此分析，在給予硫酸鋅進行誘導后能夠提高肺組織中的金屬硫蛋白含量，從而增強其抗細胞凋亡的作用[9]；而且資料還顯示，標準組中的超氧化物歧化酶活性明顯低于對照組和實驗組的超氧化物歧化酶活性，而且標準組的丙二醛含量和髓過氧化物酶的活性明顯高于對照組和實驗組的丙二醛含量和髓過氧化物酶活性，差異有統計學意義。而且標準組的大鼠肺組織超微結構存在異常，而實驗組的大鼠肺組織超微結構異常情況明顯改善[10]。

通過對相關因素和肺組織細胞凋亡指數的分析，丙二醛含量和髓過氧化物酶與肺組織細胞凋亡指數呈正相關，而超氧化物歧化酶和金屬硫蛋白與肺組織細胞凋亡指數呈負相關。由此說明，在術前給予硫酸鋅能夠有效誘導金屬硫蛋白含量增加，并使其能夠直接作用于脂質過氧化的反應和中性粒細胞的聚集，從而改善肺組織超微結構的異常情況，并有效地減輕對再灌注肺細胞的凋亡。

綜上所述，在給予硫酸鋅誘導金屬硫蛋白后，能夠有效地降低再灌注肺細胞的凋亡。

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（收稿日期：2013-01-28）