嚴重燒傷膿毒癥患者骨骼肌蛋白降解變化機制研究

[摘要] 目的 研究嚴重燒傷膿毒癥患者骨骼肌蛋白降解變化及機制。 方法 2012年1～6月收集嚴重燒傷伴膿毒癥患者8例為膿毒癥組。同時選擇整形患者10例作為對照。檢測對照組及膿毒癥組傷后3、5、7、14、21 d血清中腫瘤壞死因子-α、皮質醇、尿液中3-甲基組氨酸的含量，以及股四頭肌中泛素基因表達和蛋白表達。 結果 膿毒癥組燒傷后3、5、7、14、21 d各指標均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.01）。膿毒癥組皮質醇、TNF-α、3-MH在燒傷后逐漸升高，7 d時達到高峰，后逐漸下降，但在21 d時仍然高于對照組。尿內3-MH的排泄量與血TNF-α和皮質素水平的變化呈正相關，r = 0.89、0.91，P < 0.01。膿毒癥組股四頭肌組織內泛素mRNA、E2-14k mRNA、C2亞基的mRNA、蛋白酶體C2亞基蛋白的表達較對照組均顯著增加。 結論 嚴重燒傷膿毒癥患者出現骨骼肌降解，與皮質醇、TNF-α升高有一定的關系。

[關鍵詞] 燒傷；膿毒癥；骨骼肌；蛋白

[中圖分類號] R644 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）13-0018-03

膿毒癥是重癥燒傷常見而嚴重的并發癥之一，常常發病急，進展快，并發器官功能衰竭，如果治療不及時，患者病死率較高[1]。因此，嚴重燒傷膿毒癥的救治一直是國內外燒傷醫學界研究的熱點、重點和亟待解決的重大疑難問題。燒傷膿毒癥時患者骨骼肌蛋白出現高分解代謝，導致負擔平衡[2]。目前關于燒傷膿毒癥時骨胳肌蛋白高分解代謝的機制尚不完全明了。在膿毒癥時，蛋白高分解代謝呈現“強制性”的特點，導致蛋白分解、糖和脂肪的利用率下降，機體負擔平衡，營養不良，最終導致多種并發癥的發生。骨骼肌約占機體細胞總量的50%，在蛋白分解代謝、負氮平衡中有重要的意義。本文的目的是探討燒傷膿毒癥患者骨骼肌蛋白降解變化及機制，為臨床上預防和控制蛋白的高代謝提供理論依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2012年1～6月在我院進行治療的嚴重燒傷伴膿毒癥患者8例為膿毒癥組，其中男6例，女2例，年齡18～47歲，平均（38.1±13.2）歲。平均燒傷面積（68.3±17.5）%，平均Ⅲ度燒傷面積達（46.8±14.9）%。所有患者均符合燒傷膿毒癥的診斷標準[3]。選擇同期住院行整形手術的患者10例為對照組，其中男7例，女3例，年齡23～45歲，平均（36.2±14.8）歲。兩組性別比、年齡比較，差異無統計學意義（P > 0.05），有可比性。所有入組患者均知情同意。

1.2 標本采集

收集對照組和膿毒癥組傷后3 d、5 d、7 d、14 d、21 d的靜脈血標本及24 h的尿標本。所有燒傷患者在切燒傷痂時順肌纖維方向切取肱二頭肌和股四頭肌標本，對照組在整形瘢痕切除術時切取股四頭肌標本。所有標本分為兩部分，一部分采用甲醛固定，一部分置液氮保存。

1.3 檢測方法

1.3.1 血標本 采集的靜脈血標本靜置分層，離心，取上清液進行檢測。血漿皮質醇和腫瘤壞死因子-α（TNF-α）采用化學發光免疫分析法進行檢測，試劑盒由上海撫生實業有限公司提供。

1.3.2 尿標本 采用高效液相色譜-熒光檢測法測定尿中3-甲基組氨酸。試劑由美國Sigma公司提供。

1.3.3 骨骼肌 ①泛素系統基因表達：一步法提取組織中的總的RNA，逆轉錄聚合酶聯反應進行擴增，引物由賽百盛生物工程技術公司提供。每份RNA中去30 μg進行變性、電泳及轉膜，在膜上標記28S rRNA條帶和18S rRNA條帶。然后將膜放入預雜交液，65℃，共5 h。將cDNA探針加入雜交A液內變性處理，冷卻后加入雜交B液中，65℃預熱。棄預雜交液，在加入雜交液，過夜。室溫洗膜，然后60℃洗膜15 min，2遍。濾紙吸干，-65℃放置24 h，自顯影。②泛素蛋白表達：骨骼肌組織石蠟包埋、切片，層厚4 μm，化臘、脫蠟。蒸餾水沖洗，浸泡于過氧化物中，取出過氧化物酶。PBS緩沖液沖洗3次，枸櫞酸鹽緩沖液中95℃，10 min，進行熱修復。分別采用正漏水和PBS液清洗，封閉5 min，加兔抗鼠泛素抗體，37℃ 2 h，PBS液清洗3次，加辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗，37℃作用1 h，PBS液沖洗3次，顯色，甲基綠復染，乙醇脫水，封片，觀察。

1.4 統計學處理

采用SPSS10.0統計學軟件進行數據處理，計數資料采用χ2檢驗，計量資料采用方差分析和t檢驗，3-甲基組氨酸與皮質醇和腫瘤壞死因子-α水平的關系采用Pearson相關性分析。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 皮質醇、TNF-α、3-甲基組氨酸結果

見表1和圖1～3。膿毒癥組燒傷后3、5、7、14、21 d各指標均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P < 0.01）。膿毒癥組皮質醇、TNF-α、3-MH在燒傷后逐漸升高，在7 d時達到高峰，后逐漸下降，但在21 d時仍然高于對照組。

2.2 尿內3-MH的排泄量與血TNF-α和皮質素水平的相關性

尿內3-MH的排泄量與血TNF-α和皮質素水平的變化呈正相關，r = 0.89、0.91，P < 0.01。

2.3 泛素基因表達和蛋白的表達

膿毒癥組股四頭肌組織內泛素mRNA的表達2.4 kb和1.2 kb的表達較對照組均顯著增加。見圖4。膿毒癥患者E2-14k mRNA的表達顯著強于對照組。見圖5。膿毒癥組C2亞基的mRNA表達明顯強于對照組。見圖6。蛋白酶體C2亞基蛋白的表達見圖7，膿毒癥組顯著強于對照組。

3 討論

膿毒癥是嚴重燒傷患者的常見并發癥，患者往往起病急、進展快，嚴重者可導致多器官功能障礙，甚至危及生命[4]。患者主要表現為精神興奮、多語、譫妄等異常，體溫驟升至39.5℃以上或劇降至正常以下，呼吸>35次/min，心率>140次/min，腹脹、腸鳴音減弱或消失，創面急劇惡化，出現膿毒性休克時出現少尿。1905年Sneve提出嚴重燒傷患者存在高代謝情況，表現為明顯的疲乏、虛弱、消瘦。在燒傷早期，骨骼肌處于高分解代謝狀態，這種分解代謝有利于機體的自我保護，為肝臟合成急性期蛋白提供游離氨基酸，為免疫系統及腸上皮細胞提供谷氨酸。但大量肌纖維蛋白的分解，造成負氮平衡，長期下去導致患者抵抗力下降，影響預后[5]。

泛素（ubiquitin）是一種存在于大多數真核細胞中的小蛋白。它的主要功能是標記需要分解掉的蛋白質，使其被水解[6]。當附有泛素的蛋白質移動到桶狀的蛋白酶的時候，蛋白酶就會將該蛋白質水解。泛素相關酶催化的一系列反應發生的整個過程被稱為泛素化信號通路。泛素蛋白降解的途徑在骨骼肌代謝中具有重要的意義。泛素化系統主要有三部分，包括蛋白酶體、泛素、泛素相關酶。泛素相關酶包括泛素活化酶、泛素偶聯酶、泛素連接酶、泛素鏈延長酶及去泛素化酶[7]。其中E2-14k酶與骨骼肌的分解代謝具有密切的關系。C2亞基是蛋白降解的中心結構。本研究顯示，膿毒癥患者泛素 mRNA、E2-14k、C2亞基mRNA的表達均顯著高于對照組，說明膿毒癥患者存在明顯的骨骼肌分解代謝。

3-甲基組氨酸是1-甲基組氨酸的同分異構體，是肌動蛋白的一個組分。1967年Johnson等發現肌動蛋白和肌球蛋白中均含有3-MH，蛋白結合狀態的3-MH主要分布在骨骼肌內。3-MH主要通過尿路排泄。當肌肉分解代謝時，3-MH同其他氨基酸一起釋放入血，然后經過尿排出。因此測定尿液中3-MH的含量是肌肉蛋白質分解代謝的可靠指標。本研究結果也顯示，膿毒癥組尿3-MH顯著高于對照組，且在燒傷后7 d達到峰值，隨后逐漸下降。

TNF-α是一種能夠直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性的細胞因子，是迄今為止所發現的直接殺傷腫瘤作用最強的生物活性因子之一，屬于炎癥因子，在機體處于感染的情況下，TNF-α分泌增加。皮質醇是由腎上腺皮質分泌的一類甾體激素，具有調節糖、脂肪、和蛋白質的生物合成和代謝的作用，還具有抗炎作用，當機體處于應激狀態時，皮質醇分泌明顯增多。本文顯示，膿毒癥患者血中TNF-α和皮質醇水平均顯著升高，且在7 d時達到高峰。而皮質醇和TNF水平的增加能夠激活泛素蛋白酶體途徑[8]，促進骨骼肌的代謝。尿內3-MH的排泄量與血TNF-α和皮質素水平的變化呈正相關，也印證了皮質醇和泛素能夠促進骨骼肌分解代謝。

綜上所述，燒傷膿毒癥患者存在明顯的骨骼肌分解代謝，其發生與膿毒癥患者血中TNF-α和皮質醇水平升高有一定的關系。

[參考文獻]

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[3] Chai K，Sheng ZY，Gao JC，et al. The characteristics and prognosis of 111 burn patients with sepsis[J]. Chinese Crit Care Med，1999，11：721-724.

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[7] 陳科，程漢華，周榮家. 自噬與泛素化蛋白降解途徑的分子機制及其功能[J]. 遺傳，2012，34（1）：5-18.

[8] 申傳安，柴家科. 腫瘤壞死因子在燒傷膿毒癥大鼠骨骼肌蛋白高分解代謝中的作用及其機制[J]. 中國危重病急救醫學，2002，14（6）：340-343.

（收稿日期：2013-01-25）