MTHFR基因C667T多態性與動脈血栓性腦梗死的關聯性研究

[摘要] 目的 研究亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C667T多態位點對血漿同型半胱氨酸（Hcy）水平的影響及其與動脈血栓性腦梗死的相關性。 方法 選取年齡、性別及危險因素匹配的動脈血栓性腦梗死患者和對照組各84例，采用熒光定量法測定血漿Hcy水平，采用PCR-RFLP技術對MTHFR基因C667T位點進行分型。 結果 病例組和對照組中MTHFR基因C667T位點基因型TT攜帶者血漿Hcy水平顯著高于基因型CC及CT攜帶者（病例組：t = 2.292，P = 0.024；對照組：t = 2.098，P = 0.039）。兩組間基因型和等位基因頻率分布差異無統計學意義（基因型：χ2=1.313，P = 0.519；等位基因：χ2=1.296，P = 0.255）。 結論 MTHFR基因C667T位點等位基因T可能與血漿Hcy水平升高有關，但等位基因T可能不是動脈血栓性腦梗死的主要危險因素。

[關鍵詞] 亞甲基四氫葉酸還原酶；基因多態性；同型半胱氨酸；動脈血栓性腦梗死

[中圖分類號] R743.33 [文獻標識碼] B [文章編號] 1673-9701（2013）17-0032-03

亞甲基四氫葉酸還原酶（methylenetetrahydrofolate reductase， MTHFR）基因C667T多態位點是腦梗死遺傳易感性研究的主要候選基因之一，但研究結果存在差異[1，2]。越來越多學者提出研究差異與腦梗死異質性有關[3，4]。MTHFR基因C667T多態位點上等位基因T引起機體同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）水平升高，促進動脈粥樣硬化形成。因此本研究以動脈血栓性腦梗死為研究對象，探討MTHFR基因C667T多態位點與腦梗死的關聯性及Hcy的中介作用。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究病例組84例為順德均安醫院2011年2月～2012年8月住院患者，經顱腦CT檢查，結合經顱多普勒、頸動脈與椎動脈彩超結果（均存在動脈粥樣硬化斑塊或狹窄），臨床診斷動脈血栓性腦梗死。其中男60例，女24例，平均年齡（74.1±10.1）歲。對照組為同期門診健康檢查者，其中男56例，女26例，平均年齡（72.3±9.6）歲，排除既往腦卒中、冠心病、周圍血管病、血液系統疾病、肝腎功能異常、嚴重感染及惡性腫瘤及2周內服用葉酸、B族維生素史者。入選對象均為本地漢族人群。兩組間年齡、性別和危險因素組成無顯著差異（表1）。本研究經順德均安醫院醫學倫理委員會批準，所有對象均簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1血漿Hcy水平測定 清晨空腹采集外周靜脈血（病例組在起病后一周采血）4 mL，2%EDTA抗凝，離心后血漿與細胞沉淀分別用于Hcy水平測定和提取基因組DNA。采用熒光生化分析技術，使用Biotech公司的Hcy試劑盒測定血漿Hcy水平。

1.2.2基因分型 采用PCR-RFLP技術進行MTHFR基因C667T位點分型。引物序列P1：5’ -CAAAGGCCACCCCGAAGC-3’，P2：5’-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3’[5]。PCR反應體系為15 μL，常規配制。反應條件：①94℃ 5 min；②94℃ 1 min；③64℃ 30 s；④72℃ 1 min；⑤返回34 個循環；⑥72℃ 5 min；⑦ 4℃ 保存。擴增產物于37℃恒溫Hinf I酶切過夜。等位基因C未經酶切長為245 bp，等位基因T被酶切至173 bp及72 bp。2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測基因型。純合子CC型僅有245 bp條帶，TT型顯示173 bp和72 bp兩條帶，雜合子CT型則顯示245 bp、173 bp和72 bp三條帶。

1.3 統計學分析

計數資料采用χ2檢驗分析，正態分布計量資料中用均數和標準差描述、用t檢驗進行比較。所有數據統計均使用SPSS 11.0軟件，以α = 0.05作為有無統計學意義的判斷標準。

2 結果

2.1 血漿Hcy水平

84例病例組血漿Hcy水平（4.1～30.9）μmol/L，平均（12.70±4.30）μmol/L；84例對照組血漿Hcy水平（3.6～25.8）μmol/L，平均（12.73±4.48）μmol/L。參照美國心臟病學會標準（<15 μmol/L為正常；（15～30）μmol/L輕度升高；（30～100） μmol/L中度升高；>100 μmol/L重度升高），病例組輕度升高22例，中度升高1例，無重度升高病例；對照組輕度升高21例，無中度升高和重度升高病例。兩組資料正態性檢驗P值均>0.05。病例組與對照組間血漿Hcy水平差異無統計學意義，見表2。

2.2 MTHFR基因C667T多態位點對血漿Hcy水平的影響

病例組中基因型為CC、CT和TT型者分別為44例、34例和6例；對照組中基因型為CC、CT和TT型者分別為51例、29例和4例。組內基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡（病例組：P = 0.870；對照組：P = 0.962）。病例組中基因型TT攜帶者血漿Hcy水平顯著高于基因型CC和CT攜帶者（t = 2.292，P = 0.024）；對照組中基因型TT攜帶者血漿Hcy水平顯著高于基因型CC和CT攜帶者（t = 2.098， P = 0.039）。基因型TT是血漿Hcy水平升高的危險因素。見表2。

2.3動脈血栓性腦梗死與MTHFR基因C667T多態位點

兩組間MTHFR基因C667T多態位點各基因型頻率分布差異無統計學意義（χ2=1.313，P = 0.519）；兩組間C667T位點等位基因C和T頻率分布差異無統計學意義（χ2=1.296，P = 0.255）。見表3。

3討論

MTHFR是體內Hcy代謝途徑的關鍵酶。MTHFR基因第4外顯子667位點上存在等位基因C和T多態現象。一般認為等位基因C為野生型，T為突變型。C與T對應氨基酸殘基分別為丙氨酸和纈氨酸。纈氨酸取代丙氨酸后使MTHFR穩定性和活性下降，引起機體Hcy蓄積，導致高Hcy血癥，從而促進動脈粥樣硬化的形成[6]。本研究結果顯示在病例組和對照組中，基因型TT攜帶者血漿Hcy水平最高，CT次之，CC最低；基因型TT攜帶者與CT及CC攜帶者血漿Hcy水平比較，差異有統計學意義，與國內外多數研究相符[7，8]。

一項納入39 005人的Meta分析提出：預防性補充葉酸在降低腦卒中風險僅輕度獲益，未達到統計上顯著性（RR = 0.93，95%CI：0.85～1.03，P = 0.16）[9]。國內有研究發現腦梗死患者血漿Hcy水平顯著高于對照組，但未證實Hcy水平升高是腦梗死的獨立危險因素[8]。事實上高Hcy血癥與腦梗死的關系尚不肯定[10]。有人提出高Hcy血癥與青少年腦梗死或隱源性腦梗死關系更為密切[11]。本次研究入選對象年齡較大，平均年齡74.1歲；危險因素較普遍，高血壓患病率超過71%；順德地區為珠三角小城，當地居民日常植物食品攝入較多。上述情況可能是本次研究未發現動脈血栓性腦梗死患者血漿Hcy水平與對照組相比無顯著差異的主要原因。

一項亞洲人群的Meta分析提示C667T位點與腦梗死發病顯著相關（OR = 1.47，95%CI：1.19～1.82，P = 0.0004）[12]。Kelly等一項包括2788例腦梗死患者和3 962例對照的Meta分析未發現MTHFR基因667位點TT基因型與腦梗死發病顯著相關（OR = 1.23，95%CI：0.96～1.58，P = 0.1）[13]。國內錢明月等的研究亦未證實MTHFR基因多態性是腦梗死發病的危險因素[8]。我們的研究發現，病例組和對照組間MTHFR基因667位點各基因型和等位基因頻率分布無顯著性差異，提示MTHFR基因667位點可能不是本組人群動脈血栓性腦梗死的危險標記。

本研究以動脈血栓性腦梗死患者為研究對象，保證了研究對象的同質性；病例組在起病后一周采血檢測血漿Hcy水平，避免卒中急性期對Hcy水平的影響，有效減少研究中的信息偏倚。然而起病后一周的納入標準排除了病情較重短期死亡的患者，可能造成一定的選擇偏倚。

[參考文獻]

[1] Sahu JK，Sriwastva M，Prakash K. An association between methylenetetrahydrofolate reductase（C677T） polymorphism and large-artery ischemic stroke[J]. Acta Neurol Scand，2012，125（1）：e1.

[2] Yu HH，Zhang WL，Shi JP. Relationship between methylenetetrahydrofolate reductase gene C677T polymorphism and susceptibility of ischemic stroke：A meta-analysis[J]. Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2011， 91（29）：2060-2064.

[3] Matarin M，Brown WM，Dena H，et al. Candidate gene polymorphisms for ischemic stroke[J]. Stroke，2009，40（11）：3436-3442.

[4] Szolnoki Z，Melegh B. Gene-gene and gene-environment interplay represent specific susceptibility for different types of ischaemic stroke and leukoaraiosis[J]. Curr Med Chem，2006，13（14）：1627-1634.

[5] Baum L，Wong KS，Ng HK，et al. Methylenetetrahydrofolate reductase gene A222V polymorphism and risk of ischemic stroke[J]. Clin Chem Lab Med，2004，42（12）：1370-1376.

[6] Malinowska A，Chmurzynska A. Polymorphism of genes encoding homocysteine metabolism-related enzymes and risk for cardiovascular disease[J]. Nutr Res，2009，29（10）：685-695.

[7] Cronin S，Furie KL，Kelly PJ. Dose-related association of MTHFR 677T allele with risk of ischemic stroke： evidence from a cumulative meta -analysis[J]. Stroke，2005，36（7）：1581-1587.

[8] 錢明月，何明利，徐丙超，等. Hcy、MTHFR基因多態性與急性腦梗死的關系[J]. 放射免疫學雜志，2010，23（6）：661-663.

[9] Lee M，Hong KS，Chang SC，et al. Efficacy of homocysteine-lowering therapy with folic acid in stroke prevention：meta-analysis[J]. Stroke，2010，41（6）：1205-1212.

[10] Ientile R，Curro' M，Ferlazzo N，et al. Homocysteine，vitamin determinants and neurological diseases[J]. Front Biosci（Schol Ed），2010，2：359-372.

[11] Pezzini A，Grassi M，Del Zotto E，et al. Common genetic markers and prediction of recurrent events after ischemic stroke in young adults[J].Neurology，2009，73（9）：717-723.

[12] Banerjee I，Gupta V，Ganesh S. Association of gene polymorphism with genetic susceptibility to stroke in Asian populations：A meta-analysis[J]. J Hum Genet，2007，52（3）：205-219.

[13] Kelly PJ，Rosand J，Kistler JP，et al. Homocysteine，MTHFR 677C→T polymorphism，and risk of ischemic stroke：results of a meta-analysis[J]. Neurology，2002，59（4）：529-536.

（收稿日期：2013-04-02）