生精湯對乳腺癌MCF—7細胞增殖影響的實驗研究

[摘要] 目的 觀察生精湯對雌激素依賴性乳腺癌MCF-7細胞增殖的影響，揭示生精湯的雌激素活性。 方法 選用乳腺癌MCF-7細胞株，應用細胞增殖實驗 （E-SCREEN法）來檢測生精湯的雌激素作用。實驗可分為空白對照組與雌激素對照組（己烯雌酚，30 μg/mL）和生精湯低、中、高劑量組（分別為500、800、1000 μg/mL），觀察給藥前后的細胞形態學變化，并運用四唑鹽比色法（MTT法）測定乳腺癌MCF-7細胞的增殖率。 結果 生精湯高、中、低劑量組均可明顯提高乳腺癌MCF-7細胞的增殖率，并呈現一定的量效關系。 結論 生精湯能顯著提高乳腺癌MCF-7細胞的增殖率，即具有明顯的雌激素樣作用。

[關鍵詞] 乳腺癌MCF-7細胞；生精湯；細胞增殖

[中圖分類號] R737.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）17-0129-03

多囊卵巢綜合征（PCOS）是婦科臨床常見的內分泌失調性疾病，近年來發病率呈上升趨勢[1]。中醫中藥從整體觀念出發，治療本病有獨特優勢。生精湯即為經過多年臨床證明能有效治療多囊卵巢綜合征的中藥復方[2，3]，由菟絲子、淫羊藿、女貞子、補骨脂等藥配伍而成。據文獻報道，生精湯中的組成中藥如菟絲子[4]、淫羊藿[5]、女貞子[6]等提取物均具有雌激素樣作用，提示本方可能是通過雌激素樣作用來對抗多囊卵巢綜合征中的雄激素過多，調節下丘腦-垂體-卵巢軸的內分泌系統紊亂，從而起到治療作用。MCF-7細胞增殖實驗即E-SCREEN法作為評價藥物雌激素活性的一種經典方法，靈敏度高，方便快捷，其原理是根據雌激素受體（ER）陽性的MCF-7乳腺癌細胞株，可在雌激素或雌激素樣物質的刺激下發生增殖[7]。因此，本實驗利用ER陽性乳腺癌MCF-7細胞增殖實驗，觀察生精湯對乳腺癌MCF-7細胞增殖的作用，評價其植物雌激素活性，揭示其對多囊卵巢綜合征的作用機制，為指導臨床婦科疾病用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1 實驗材料 生精湯由以下各味中藥組成：菟絲子、淫羊藿、女貞子、補骨脂、熟地、山藥、雞血藤、劉寄奴、王不留行、制香附、生麥芽，均購置于浙江中醫藥大學中藥飲片廠。

1.1.2 細胞株 人乳腺癌MCF-7細胞株購自于中國科學院上海細胞生物學研究所。本實驗室液氮保存。

1.1.3 主要試劑 陽性藥物為己烯雌酚，北京益民藥業有限公司生產，批號0504100。胎牛血清（08028）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；培養基RPMI1640（12100-045）為Gibco公司產品；噻唑藍MTT（08002）為華美生物工程公司進口分裝產品；1：250胰蛋白酶（080535）為吉泰科技有限公司進口分裝產品；二甲基亞砜（分析純，54186）為江蘇鴻聲化工廠產品；青霉素和鏈霉素來自于上海先鋒藥業有限公司。

1.2 方法

1.2.1 主要試劑的配制 ①D-Hanks液配制 于700 mL重蒸水中分別加入8.00 g NaCl、0.40 g KCl，0.06 g Na2HPO4·7H2O，0.06 g KH2PO4、0.35 g NaHCO3及0.02 g酚紅，定容至1 L，調pH值至7.2～7.4，分裝于小瓶后10磅30 min高壓滅菌。②胰蛋白酶溶液配置 1：250胰蛋白酶2.5 g，溶于1L經高壓消毒滅菌的D-Hanks中， 0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，無菌條件下分裝儲存于-20℃冰箱備用。使用時加D-Hanks溶液稀釋成0.08%的胰蛋白酶溶液。③培養液配置 約300 mL三蒸水中緩慢加入培養基干粉，攪拌使之溶解；再將NaHCO3溶于約200 mL三蒸水后加到上述溶液中，定容至1 L，0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，無菌條件下分裝保存于-20℃冰箱備用。使用時加青霉素和鏈霉素（終濃度均為100 U/mL）以及滅活新生牛血清（終濃度為10%～20%）。④抗生素液配置 青霉素和鏈霉素溶于D-Hanks溶液中，使其終濃度均為10000 U/mL， 0.22 μm微孔濾膜負壓過濾除菌后分裝儲存于-20℃冰箱備用。⑤PBS溶液配置 于700 mL蒸餾水中依次加入8.00 g NaCl、0.20 g KCl、1.56 g Na2HPO4·7H2O和0.20 g KH2PO4，定容至1 L，充分混勻，分裝后10磅30 min高壓滅菌。

1.2.2 細胞培養 將人乳腺癌MCF-7細胞接種于含10%胎牛血清、100 U /mL青霉素和100 U/mL鏈霉素的RPMI1640培養液中，在體積分數為5%CO2、37℃恒溫條件下進行培養。每日觀察細胞生長情況，換液周期為2～3 d一次，貼壁長滿后用0.25%胰蛋白酶消化，加入培養液吹打制成細胞懸液進行傳代，并取對數生長期細胞進行實驗。實驗開始前4 d用PBS溶液洗滌細胞2次后，改在無酚紅RPMI-1640中培養，以耗盡細胞內儲存的雌激素。倒置顯微鏡觀察經生精湯作用后的細胞形態學改變。

1.2.3 藥物制備 陽性藥物：己烯雌酚用三蒸水制成30 μg/mL的懸濁液。生精湯組：按處方藥量稱取各藥材，加10倍量、8倍量水分別煎煮2 h、1.5 h，合并水煮液，并濃縮至浸膏，以三蒸水稀釋成濃度為1 mg/mL的貯存液。用無菌膜過濾器濾過除菌后，-20℃冰箱保存備用。實驗前加入無酚紅的RPMl-1640培養液（含10%FBS）中，稀釋至所需濃度。

1.2.4 實驗分組 分為空白對照組（細胞+培養基）、雌激素對照組（己烯雌酚，30 μg/mL）和生精湯全方低、中、高劑量組（分別為500，800，1 000 μg/mL）。

1.2.5 MTT法檢測生精湯對MCF-7細胞增殖的影響 用不含牛血清的1640培養液培養的乳腺癌MCF-7以1×104/孔接種于96孔板，37℃ 5%CO2的培養箱中培養24 h后，細胞60%～75%融合，將細胞分為5組，每組6復孔。繼續培養48 h后加入噻唑藍孵育4 h，棄去上清，加入二甲基亞砜150 μL震蕩10 min，應用酶標儀于波長570 nm處測定各孔吸收值（OD值），計算平均OD值和增殖率。

1.3統計學分析

采用SPSS18.0統計軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，單因素兩水平資料均數比較采用t檢驗，單因素多水平采用單因素方差分析，組間比較采用LSD-t檢驗。P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1細胞形態學觀察

置培養箱中繼續培養細胞，倒置相差顯微鏡下觀察各處理因素加入后 24 h和48 h時，不同處理因素對人乳腺癌MCF-7細胞生長狀態的影響。結果如下：空白對照組：細胞單層貼壁生長，生長舒展，僅少許細胞呈懸浮生長；胞漿飽滿、透亮，具多個突起，細胞核圓形或橢圓形。己烯雌酚組：細胞貼壁生長旺盛，輪廓清晰，胞間結構緊密，幾乎無脫落，且胞漿飽滿，胞核圓形或橢圓形。48 h后觀察可見相鄰細胞生長緊密，成片融合。生精湯各組：細胞呈集落性貼壁生長，偶見細胞脫落懸浮生長。48 h后觀察可見：細胞輪廓清晰，胞漿飽滿，折旋光性強，相鄰細胞部分可見有融合，甚至可見成片生長。

2.2 MTT法觀察生精湯對MCF-7細胞增殖的影響

由表1和圖1結果可知，予己烯雌酚可誘發MCF-7細胞增殖顯著加快，與空白組比較有極顯著差異（P < 0.01）。與陽性藥己烯雌酚組比較，生精湯的低、中劑量組效果不及陽性藥，高劑量組效果與陽性藥比較差異無顯著性（P > 0.05），說明效果相當。從增殖率上來看，生精湯高、中、低劑量組給藥均可見MCF-7細胞增殖加速，并且存在量效關系。

3 討論

從本實驗結果中可見，生精湯高、中、低劑量組均可使MCF-7細胞增殖顯著加速，具有明顯的雌激素樣作用。究其原因，我們認為組成生精湯中的中藥含有植物雌激素，它們與雌激素結構相似，所以可與雌激素受體相結合而發揮一定的雌激素作用。文獻報道補骨脂含有總香豆素如補骨脂素，菟絲子、淫羊藿含有黃酮類成分。這些木脂素、香豆素、黃酮類成分均為植物雌激素[8]，因此，我們也可以認為這些化合物是生精湯具有雌激素樣作用的物質基礎和作用途徑。

植物雌激素的結構特征與雌二醇相似，都具有一對羥基和一個酚環，所以可以與哺乳類動物及人類的雌激素受體相結合并將其激活，該類化合物已被證實存在于多種植物中，尤其是在活血化瘀藥和補益藥中，而用于治療多囊卵巢綜合征的生精湯中中藥多為補腎活血藥。

此外，一種植物常含有不止一種甚至多種植物雌激素，因一種藥物往往不止含有一種植物雌激素，特別是中藥復方內不同成分間的聯合作用和相互影響也應引起人們的注意，因此檢測它們聯合應用時的效果更能反映其在機體內發揮作用的真實情況。

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（收稿日期：2013-04-18）