電生理膜片鉗技術教學中的一些心得

摘 要 膜片鉗技術是電生理學研究中的重要技術，越來越多地被應用于檢測細胞離子通道、動作電位、分泌特性等研究中。然而這個系統由于其相對復雜，操作較為難于上手，往往使得沒有接受過系統訓練的學生比較難使用這一系統獲得正確的數據而陷入困境。所以有必要開設課程進行教學。作者對課程中一些須特別注意的環節進行了系統的闡述，以其協助老師們更好地對這門課程進行教學。

關鍵詞 膜片鉗技術 電生理學 生物電信號

中圖分類號：G424 文獻標識碼：A

電生理學是生理學的一個分支，是一門研究生物細胞或組織的電學特性的科學。主要研究對象包括細胞膜電勢變化、離子通道的性狀、跨膜電流的調節以及可興奮性細胞的動作電位等。電生理學研究中，主要利用物理學的研究方法來探討生物學問題，最核心的手段就是用膜片鉗放大器進行生物電信號的檢測。這是一類比較“專家向”的設備，因此必須開設專門的課程對學生進行深入的膜片鉗相關技術的教學，使其在科研過程中少走彎路，順利的開展工作。

膜片鉗技術屬于物理學和生物學的交叉學科，教學難度較大，在實際教學過程中需要注意一些與傳統生命科學課程不同的問題。

1 合理融會多種相關教材

目前在我國發行的膜片鉗技術相關教材主要有康華光版、陳軍版、劉振偉版三種，各有其不同的側重點，但都不是非常適合用于膜片鉗技術教學課程。康華光版教材側重于對膜片鉗硬件結構的解析，更多的是對膜片鉗電路原理方面的描述，比較少地對具體實驗內容給出指導，學生容易對諸多的電學原理產生抵觸情緒；陳軍版教材側重于生命科學實驗教學，比較少涉獵放大器工作原理類內容，也不利于學生對膜片鉗技術的深刻理解；劉振偉版教材對硬件相關原理和生命科學實驗相關都有比較深入的探討，但是內容較為繁雜，學生比較難于把握，并且其中摻雜大量類似于Axon公司產品說明書翻譯的內容，并不適合所有用戶。筆者認為，在實際教學中，可以用陳軍版或劉振偉版中宏觀的與生命科學具體實驗相關的內容為藍本，添加對實際工作有比較大促進作用的儀器相關知識，如：如何選擇合適的反饋電阻、如何排除外界干擾信號等。而對于一些針對特別具體實驗的內容，如怎樣制備大鼠腦片、怎樣進行海馬腦片記錄、怎樣在新生大鼠離體腦干——脊髓標本上進行實驗等，則不必列入課程范圍內，因為在學生可以查找到的文獻中有更新、更完備、更切合實際工作的方法，不需要在課堂上進行這些內容的訓練。我們課程的宗旨是讓學生理解膜片鉗系統的工作原理，并指導其將具體實驗與放大器原理結合起來進行科研工作，而非手把手地進行實驗方法教學，何況這些教科書上的實驗方法很容易被時間所淘汰。至于教材中關于如何連接數模轉換線路、如何使用某一種采集軟件的內容，也不必列為教學內容。因為這些都是在儀器說明書中所包含的內容，并且隨著設備的更新換代會有所改變，學生可以通過閱讀說明書來獲得更準確的信息。

2 針對學生的特點因材施教

進行膜片鉗技術學習的學生絕大多數為理科背景主修生命科學或者醫科背景主修醫學方面的學生。這些學生的工科知識很薄弱，比較難于理解膜片鉗放大器系統是如何進行工作的。因此在教學過程中，不必強求其理解放大器的工作原理，如：膜片鉗放大器是如何降低噪聲？為什么要采用多階低通濾波？這些問題比較枯燥，沒有接觸過電學方面課程的學生容易失去興趣，只需要他們掌握大致的概念即可，即為什么要濾波，低通濾波的優點和缺點是什么，并用濾波前后的具體數據進行比較。再有比如噪聲的分類方式及其計算公式，不必過分深入，只需要學生掌握可以降低噪聲的手段即可，如在電極尖端涂覆樹脂、減少內液使用量等。但有必要對他們強化跟電生理學測量相關的放大器方面知識，如：P/N漏減（P/N leak substraction）這個知識點，就不可這樣一帶而過，而是需要明確P/N 漏減功能是怎樣實現的？為什么要進行P/N漏減操作？這里需要注意的是，要采用更合適理科背景學生理解的方式進行教學。如果參照傳統課本中的模式，先提出P/N漏減的概念，再給出計算方法，最后提出應用范圍，往往收不到良好的效果，因為學生已經陷入繁雜的理論體系中。這時應該改換一種模式，首先拿出尚未進行P/N漏減的膜片鉗數據如鈉離子電流數據和標準的文獻中的做比較，再告訴學生，產生這樣數據差距的原因，主要是因為線性被動反應電流導致也就是通常所說的漏電流導致的。接下來對P/N漏減模式進行詳細解釋：給出細胞電生理等效模式圖，指出當細胞膜內外電壓差發生變化時，細胞作為電路中的等效電阻電容并聯體系，其電阻會有電流通過，電容會有充放電反應，也就是產生了電阻電流和電容電流，對于這種電流干擾，是不能簡單地通過平移曲線來消除其影響，因此需要引入P/N漏減的方法，在向細胞給出幅度為€%d階躍刺激獲得實驗所需電流數據之前，向細胞施加n個階躍電壓，其電壓為€%d/n，這些較小的階躍電壓可以選擇與階躍刺激方向相同，也可以選擇相反，這樣將這些階躍電壓所得的被動反應電流加和就可以得到在幅度為€%d階躍時候會產生的漏電流，通過曲線間加減法即可消除漏電流的影響。同時，要指出這樣做的缺陷——會增大信號的噪聲。這樣，可以使學生更深刻地理解這一概念，并且懂得在哪種情況下需要采用這個方式進行漏電流剪除，以及P/N漏減操作之后會對數據產生怎樣的影響。

3 授課教師應該對膜片鉗有深入的理解

膜片鉗技術從表面上看只是對膜片鉗放大器相關系統的應用來采集微弱的生物電信號，但事實上，對不同的樣本，不同類型信號的測量，有非常多的決定成敗的細節。這就要求授課教師不能僅僅依賴教材和論文，而要親身實地盡可能多地涉獵不同類型的實驗，才不至于在授課中由于自己的“想當然”而誤導學生。如膜片鉗的主要測量模式為貼附式、全細胞模式、細胞膜內向外模式、細胞膜外向外模式。曾經很多老師會認為，其中的貼附式是獲得數據最簡單、技術含量最低的一種，比全細胞模式要容易很多，因為全細胞模式記錄是在貼附式記錄基礎上，吸破細胞和電極接觸部分的細胞膜形成的，換句話說進行全細胞模式記錄之前先要形成貼附式封接。然而事實并非如此。在膜片鉗實驗中，一般要求玻璃電極和細胞之間實現高阻抗封接也就是通常說的G歐封接。對于全細胞模式的記錄來講，由于信號較大，全細胞電流一般在數百pA到數千pA，因此達到大約1G歐姆左右的封接，信噪比就足以準確的測定實驗信號。所以雖然全細胞模式比貼附式要多一次將封接點細胞膜吸破的工序，但一般而言50%以上的細胞在吸破之后仍然可以保持G歐封接，可以獲得有效的數據。而反觀貼附式記錄模式，一般要測定的是被封接區域上的單通道電流，多在10pA以下，這就需要封接電阻至少要達到10G以上才可以記錄到單通道電流。而可以達到10G以上封接的細胞并不特別常見，并且并不是每一次都可以準確地將離子通道封在電極中。因此一般而言，可以說貼附式記錄獲得實驗數據的難度要大于全細胞模式。再比如常見的動作電位的記錄。膜片鉗教科書上所給出的記錄模式圖均取自最初的雙電極電壓鉗細胞內記錄，即在一根電極處給出短促的方波電壓刺激，在另一處電極處處于靜息狀態下記錄細胞的動作電位。但是，其實用這種記錄方式來描述常見的動作電位記錄是不準確的。目前使用膜片鉗系統進行的動作電位記錄，大多數是單電極測試，也就是從同一根探頭給出去極化刺激并且同時檢測膜電流的變化來測定動作電位。這兩種情況下，動作電位產生的原理是相同的，可以說反映了類似的細胞活動，但是不能完全等同起來，后者的采集過程中，細胞處于一個較長時間的胞內電勢去極化的狀態，主要用來測試細胞動作電位的發放頻率（Fire rate），而前者主要用來測試細胞對于某種短促刺激的響應能力，這里需要著重給學生分析清楚。

4 指導學生使用合適的科研用分析軟件

目前主流的膜片鉗設備主要為美國產Axopatch系列和HEKA的EPC系列，兩類產品均需要特定的數據處理軟件，如前者需要Clampfit，后者需要Igor。這些軟件比起常用的辦公系列軟件來說要復雜很多，比如Igor，其英文說明書就有兩千多頁，學習起來比較困難。盡管如此，建議老師還是應該精通這些軟件并且指導學生用這些專門的科研分析軟件進行數據處理和作圖，以免發生錯誤。如膜片鉗數據是一個一個數據點排列成的數組，很多時候多達幾萬甚至幾十萬個，如果將膜片鉗數據導出成數組，用excel來處理，雖然操作較為順手，但是excel對于單列是有上限的，會直接砍掉一部分數據，造成分析結果異常。并且科研專用分析軟件如果運用合理的話，可以按照刊物的需求做出合乎自己需求的圖，甚至可以在軟件內部編寫出可以對數據進行自動化處理的小程序來極大地提高工作效率，而常規辦公軟件是無法完成這些工作的。

綜上所述，電生理膜片鉗系統是當今生理學科研中非常重要的系統，但由于其難于精通，所以單單靠日常訓練難于讓學生正確地利用這個系統進行科研任務。因此，有必要用一系列課程合理地對學生進行培訓，切實地分析這一課程與其他傳統生理學或者物理學課程的差別，選擇合適的方式進行教學，才能使學生更深刻地理解這一系統，來更有效地完成相關科研任務。

參考文獻

[1] 陳軍.膜片鉗實驗技術.北京：科學出版社，2001.

[2] 康華光等.膜片鉗技術及應用.北京：科學出版社，2003.

[3] 劉振偉.實用膜片鉗技術.北京：軍事科學出版社，2006.