Th17細胞在小鼠H22原位肝癌模型中的表達和意義

[摘要] 目的 檢測小鼠原位肝癌模型中Th17細胞的表達，探討其在肝癌免疫中的作用。 方法 30只Balb/C小鼠隨機分為肝癌模型組（10只）、生理鹽水對照組（10只）、空白對照組（10只），流式細胞術檢測小鼠分離純化后的各組新鮮脾臟Th17細胞的相對比例；實時RT-PCR檢測各組肝組織IL-17基因和RORγT基因表達水平。 結果 肝癌模型組脾臟Th17/ CD4+T細胞的比例高于生理鹽水對照組脾臟、空白對照組脾臟，差異有統計學意義（P < 0.01），而各對照組之間的比例差異無統計學意義（P > 0.05）。肝癌模型組腫瘤組織IL-17 mRNA和RORγT mRNA的表達水平均高于各自對照組，差異有統計學意義（P < 0.01），而IL-17 mRNA和RORγT mRNA在各自對照組之間表達水平的差異無統計學意義（P > 0.05）。 結論 Th17細胞在小鼠原位肝癌模型中數量增多，IL-17表達升高，增強免疫反應，但在肝癌免疫中的作用及機制復雜，有待深入研究。

[關鍵詞] 肝癌模型；Th17細胞；IL-17；RORγT

[中圖分類號] R735.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）35-0005-03

肝細胞癌（hepatocellutar carcinoma，HCC）是世界上最多見的五大惡性腫瘤之一，死亡率列前三位[1]，我國是HCC多發國家。但目前以手術為主的綜合治療方法療效仍不理想，故近年來免疫治療越來越受到重視。

Th17細胞是一種以分泌IL-17為主要特征的CD4+T細胞，孤核受體RORγT是其特異的轉錄因子。Th17細胞首先是在EAE和CIA的研究中被發現，現研究表明IL-17的表達和人類很多自身免疫性疾病有關，如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、炎癥性腸病等[2-4]。最近研究發現，在一些腫瘤患者或小鼠腫瘤模型的腫瘤標本中Th17細胞明顯升高，但是關于Thl7和HCC的研究，國內鮮有見到相關的報道。故本研究通過建立Balb/C小鼠原位荷瘤模型，檢測脾臟中Th17細胞的比例、腫瘤微環境中IL-17基因和RORγT基因的表達，為能進一步系統地研究Th17細胞在肝癌免疫中的作用和機制打下良好的基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1動物：6～8周齡SPF級雄性Balb/C小鼠，體重（20±2）g。30只小鼠隨機分為肝癌模型組、生理鹽水對照組、空白對照組，各10只進行實驗。

1.1.2腫瘤細胞株 鼠源性H22腹水型肝癌細胞株。

1.1.3抗體和試劑 FITC Rat Anti-Mouse CD4、PE Rat Anti-Mouse IL-17A購自美國BD公司；SYBR Green Supermix 購自美國Bio-rad，PCR引物由上海浦生生物科技有限公司合成。

1.2方法

1.2.1 小鼠原位肝癌模型的建立 H22肝癌細胞注入Balb/C小鼠腹腔，后抽取癌性腹水調整細胞濃度備用。肝癌模型組：小鼠麻醉后，開腹直視下將0.01 mL癌細胞懸液注入肝臟。生理鹽水對照組：肝內注入0.01 mL生理鹽水。模型制作后第30天處死小鼠取肝臟腫瘤組織固定，常規HE染色， 進行病理組織學診斷。

1.2.2 Th17細胞流式檢測 ①取肝癌模型組、生理鹽水對照組、空白對照組脾臟，機械法分離細胞，紅細胞裂解液去除紅細胞。②獲得的各組脾臟單個核細胞按照免疫磁珠操作規程分選CD4+T細胞。③CD4+T細胞接種于24孔培養板，加入PMA，Ionomycin，Monensin，使其終濃度分別為125 ng/mL，1 μg/mL 和1。6 μg/mL，在37℃、5%二氧化碳的環境下培養4h。④取細胞懸液，先后加入CD3-PE-CY5，FITC Rat anti-mouse CD4標記細胞表面抗原，PE Rat Anti-Mouse IL-17A胞內染色，設同型對照組。用FACS Calibur流式細胞儀檢測，以CD4，IL-17A雙陽性細胞占CD4+T細胞的百分比記錄結果。

1.2.3 實時熒光定量PCR檢測 Trizol法提取各組總RNA，反轉錄合成cDNA。由SYBR Green Supermix，forward primer，reverse primer，cDNA等試劑建立一個10 μL 的反應體系（引物設計見表1），放入ABI高通量熒光定量PCR儀7900HT進行反應，反應條件：開始50℃ 2 min ，95°C 10 min，接著95°C 15 s 和 60°C 1 min共45個循環。最后根據待測基因和內參的循環數CT值，使用2 -△△CT方法進行相對定量結果分析。

1.3統計學方法

采用SPSS17.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較均采用單因素方差分析，P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1小鼠原位肝癌模型建立

病理檢查示肝癌組織正常肝小葉結構消失，瘤細胞異型性明顯，大小、形態不一，核大、深染，腫瘤細胞排列緊密， 與周圍的肝組織分界較為明顯，腫瘤組織壞死明顯（圖1）。

2.2流式檢測Th17細胞的相對比例

肝癌模型組脾臟Th17細胞占CD4+T細胞的比例（1.79±0.45）%高于空白對照組脾臟（0.17±0.17）%和生理鹽水對照組脾臟（0.20±0.09）%，差異有統計學意義（P < 0.01），而空白對照組脾臟、生理鹽水對照組脾臟之間Th17細胞占CD4+T細胞的比例差異無統計學意義（P > 0.05），見表2和圖2。

2.3 IL-17基因和RORγT基因表達檢測結果

2.3.1 肝癌模型組腫瘤組織IL-17mRNA的表達 其水平（3.70±0.43）高于空白對照組肝臟組織（0.79±0.13），生理鹽水對照組肝臟組織（0.84±0.39）和肝癌模型組癌旁遠端組織（0.70±0.27），差異有統計學意義（P < 0.01），而各對照組之間IL-17mRNA的表達水平差異無統計學意義（P > 0.05）（表3）。

2.3.2 肝癌模型組腫瘤組織RORγTmRNA的表達水平 其水平（14.63±4.28）高于空白對照組肝臟組織（7.63±0.64），生理鹽水對照組肝臟組織（7.86±1.77）和肝癌模型組癌旁遠端組織（9.92±2.74），差異有統計學意義（P < 0.01），而各對照組之間RORγTmRNA的表達水平差異無統計學意義（P > 0.05）（表3）。

表1 IL-17基因和 RORγT基因引物設計

注：F：上游引物，R：下游引物

表2 各組脾臟Th17細胞占CD4+T細胞的相對比例（x±s）

注：肝癌模型組與各對照組（標記*）比較，F=43.570，P < 0.01

表3 腫瘤組織及各組肝臟組織中IL-17mRNA及RORγTmRNA的表達（x±s）

注：肝癌模型組與各自相應的對照組（標記*）比較，aF = 200.110 ，aP < 0.01； bF = 14.369 ，bP < 0.01

3 討論

肝癌患者的細胞免疫功能受到抑制，機體的細胞免疫機制可以控制肝癌的發生和發展， CD8+細胞毒性T淋巴細胞有直接殺傷肝癌細胞的作用，CD4+T細胞則是調控CTL功能的重要細胞。Th17細胞是一種分化途徑不同于Thl和 Th2型細胞的CD4+T細胞。

目前關于Th17細胞在腫瘤免疫中的作用知道的還較少，其在不同腫瘤環境的作用不盡相同。如卵巢癌患者和正常人外周血中Th17細胞比例的差異無統計學意義，但在腫瘤浸潤淋巴細胞中，Th17細胞的比率顯著上升[5]；Zou[6]研究發現在B16黑素瘤晚期表達水平明顯增高，且在外周血、骨髓、脾臟及癌組織中均升高。關于Th17細胞和肝癌的關系，曾有一項研究報道，Th17細胞水平增高與腫瘤大小、門脈癌栓、遠處轉移、TNM分期有明顯關系[7]。

本實驗主要研究肝癌環境中的Th17細胞。首先研究了肝癌模型中脾臟Th17細胞的表達，和各對照組相比，表達明顯升高，有統計學差異。但HCC轉移的生物學行為和不良預后很大程度上可能被局部的炎癥狀態所決定或影響[8]，所以對腫瘤微環境中Th17細胞進行檢測很重要。結果顯示IL-17mRNA和RORγTmRNA的表達水平，和各對照組相比，均明顯升高，有統計學差異。IL-17作為Th17細胞分泌的最特征性細胞因子，RORγT是控制Th17細胞分化的關鍵性轉錄因子，腫瘤組織中IL-17mRNA和RORγTmRNA表達水平的升高從基因水平證實Th17細胞在腫瘤組織中是升高的。實驗結果提示Th17細胞在HCC腫瘤微環境和外周免疫器官的變化存在一致性。

國外最近相似的研究結果顯示，Th17細胞在腫瘤組織內的表達顯著高于癌旁正常組織，是HCC預后差的獨立危險因素，而且瘤內的Th17細胞與腫瘤的微血管密度呈正相關，提示Th17細胞通過培養血管生成促進腫瘤進展[9]。HCC是一種典型的慢性炎癥背景上發生的惡性腫瘤，以前研究表明，STAT3信號通道及IL-23等重要細胞因子與癌癥相關性炎癥有關，而Th17細胞與它們關系密切，有可能成為癌癥治療的新靶點[10]。

以上報道提示Th17細胞促進腫瘤進展，但也有抗腫瘤作用的相關報道。在肝癌患者的腫瘤組織內CCL20顯著增多，Th17細胞表達CCR6，二者可特異性結合誘導Th17細胞遷移，而腫瘤微環境中的TNF-α、IL-17A等又可促進CCL20的分泌，并通過CCL20/CCR6依賴的方式來募集Th17細胞[11]。 Th17細胞可以通過CCR6/CCL20途徑調節樹突狀細胞募集來間接發揮抗腫瘤免疫效應[12]。由此可以推測肝癌中Th17細胞可通過CCR6/CCL20途徑間接發揮抗腫瘤免疫效應，而且提示Th17細胞的分化和遷移與腫瘤的發生與發展有關，并通過腫瘤微環境中的細胞因子聯系起來。

Thl7細胞分泌IL-17，IL-22等多種細胞因子。IL-17主要由Th17細胞產生，通常所說的IL-l7就是指IL-17A。IL-17作為一類重要的炎性細胞因子，可以與多種細胞表面的IL-17受體結合并激活它們，進而釋放多種細胞因子、趨化因子以及炎性介質，并促進細胞表面粘附分子的表達，因此具有增強免疫反應的作用，這是比較確切的。但相關文獻報道肝癌患者瘤內IL-17的表達升高和HCC患者的不良預后顯著相關[13]，還有研究表明肝腫瘤切除后殘余肝組織中存在的產生IL-17的T細胞可能加重局部肝損傷[14]，提示IL-17在肝癌中發揮著重要作用。國外有項研究發現，IL-17在體外能增強肝癌細胞的侵襲能力，在體內可明顯促進肝癌荷瘤小鼠腫瘤局部血管形成和對中性粒細胞的招募，從而起到促進腫瘤生長的目的[15]。但近段時間又發現IL-17可以通過促進腫瘤組織中樹突狀細胞的產生，促進腫瘤特異性CD8+T細胞活性來參與抗腫瘤免疫。所以IL-17在肝癌抗腫瘤活性的機制很大程度上還是未知的。

綜上所述，Th17細胞在小鼠肝癌模型中數量增多，IL-17表達升高，增強免疫反應。但同時可以看出Th17細胞具有多效性，在肝癌中的作用復雜，IL-17在肝癌中的作用及機制等仍不明確。我們希望通過后續實驗的深入研究，能為肝癌的免疫治療提供新的思路。

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（收稿日期：2013-10-09）