甘藍(lán)型油菜F1代小孢子的培養(yǎng)方法初探

【摘 要】通過(guò)對(duì)油菜小孢子離體誘導(dǎo)培養(yǎng)，筆者研究了我院甘藍(lán)型油菜種間雜種F1組合的小孢子離體培養(yǎng)產(chǎn)生胚狀體，再進(jìn)行成苗、生根培養(yǎng)，獲得了有效植株的方法。試驗(yàn)表明，離體小孢子能在3～4周內(nèi)獲得發(fā)育良好的子葉型胚狀體，把胚狀體轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，經(jīng)2周后直接或再次分化成苗，再轉(zhuǎn)入MS生根培養(yǎng)基上培養(yǎng)出幼苗。

【關(guān)鍵詞】甘藍(lán)型油菜；F1代小孢子；培養(yǎng)方法；培養(yǎng)基

游離小孢子具有單倍體核、單細(xì)胞和較高同步性等特點(diǎn)，小孢子培養(yǎng)已成為從甘藍(lán)型油菜中獲得大量單倍體的主要途徑[1]。游離小孢子經(jīng)離體培養(yǎng)和染色體加倍后能獲得純和的雙單倍體植株，小孢子離體培養(yǎng)是加快育種進(jìn)程的有效方法。本文對(duì)游離小孢子離體培養(yǎng)進(jìn)行了研究，以期對(duì)我院油菜育種起到一定的促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

我院油菜研究所提供的F1代組合M01167、M01135。

1.2 培養(yǎng)基

（1）洗液 B5（含B5大量、B5微量、鐵鹽、B5有機(jī)），pH6.0，蔗糖濃度13%。

（2）小孢子誘導(dǎo)液體培養(yǎng)基：NLN+6BA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+秋水仙素10mg/L，蔗糖濃度13%，pH值為6.0；固體培養(yǎng)基：NLN+3g/L藥用炭+15g/L瓊脂，蔗糖濃度13%，pH值為6.0。液體培養(yǎng)基采用0.22nm孔徑濾膜抽濾滅菌，固體培養(yǎng)基采用高壓滅菌。

（3）分化培養(yǎng)基：MS+6BA0.2mg/L +NAA0.1mg/L+蔗糖2%+瓊脂12mg/L，pH值為6.0，高壓滅菌。

（4）生根培養(yǎng)基：NAA0.1 mg/L+IAA 0.2mg/L蔗糖3%+瓊脂8 mg/L，pH值為6.0，高壓滅菌。

1.3 培養(yǎng)方法

小孢子的培養(yǎng)程序按牛永澤[2]等描述的方法進(jìn)行。采集初蕾期油菜花蕾，置于4℃冰箱中低溫預(yù)處理1～4d，然后摘下大小適中的花蕾，在超凈工作臺(tái)上、無(wú)菌條件下，先用無(wú)菌蒸餾水沖洗干凈，加入75%酒精消毒6～8min，再用蒸餾水清洗3次，然后用B5洗液再洗滌2次，研磨花蕾，按1.0蕾/ml加入NLN誘導(dǎo)培養(yǎng)基，定容，將小孢子懸浮液分裝于直徑為6cm的鋪一層固體NLN培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，每皿3ml，用封口膜封口，置于32℃黑暗條件中培養(yǎng)48h，然后再轉(zhuǎn)移到25℃的暗室中培養(yǎng)2周，待胚形成后轉(zhuǎn)入到25℃的搖床中培養(yǎng)（60次/min）。3周后把形成的胚狀體轉(zhuǎn)移到MS分化培養(yǎng)基中，培養(yǎng)約3周形成苗，再把形成的苗轉(zhuǎn)移到MS生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)成實(shí)生苗。

2 結(jié)論與小結(jié)

近年來(lái)，隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展與完善，游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種上的應(yīng)用日漸廣泛，大大加快了油菜的育種進(jìn)程。本研究以我院大田栽培環(huán)境下的甘藍(lán)型油菜為材料進(jìn)行了油菜游離小孢子培養(yǎng)，同時(shí)對(duì)小孢子胚狀體發(fā)生條件進(jìn)行了研究。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，采用小孢子懸浮固液雙層培養(yǎng)能在3～4周內(nèi)獲得發(fā)育良好的子葉型胚狀體，成胚量多少不等，平均能達(dá)到5～8個(gè)/蕾；油菜小孢子取材時(shí)間對(duì)小孢子胚胎發(fā)生影響較大，以始花期產(chǎn)胚數(shù)最高、培養(yǎng)效果最好，因而始花期為最佳取蕾時(shí)期，盛花期次之；把胚狀體轉(zhuǎn)入MS固體培養(yǎng)基中，經(jīng)3周后直接或再次分化成苗；在相同的培養(yǎng)條件下，基因型是決定成胚率高低的重要因素，M01167比M01135平均多2個(gè)/蕾；在培養(yǎng)基中加入適量的秋水仙素是單倍體加倍的主要途徑，但過(guò)高的秋水仙素濃度對(duì)胚有毒害作用，會(huì)抑制胚的形成；前期低溫處理能有效促進(jìn)甘藍(lán)型小孢子的分化，在一定程度上可以提高小孢子的成胚量，細(xì)胞分裂素0.1mg/16-BA的應(yīng)用可促進(jìn)小孢子胚胎發(fā)生率；藥用炭對(duì)胚胎發(fā)生沒(méi)有顯著影響，但改善了小孢子的生存環(huán)境，以低溫處理2d的效果為最佳，隨著花序低溫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，小孢子的產(chǎn)胚率也有下降趨勢(shì)。

參考文獻(xiàn)

[1]余鳳群，劉后利.供體材料和培養(yǎng)基成分對(duì)甘藍(lán)型油菜小孢子胚狀體產(chǎn)量的影響[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1995，14（4）：327-321.

[2]牛應(yīng)澤，劉玉貞，汪良中等.人工合成甘藍(lán)型油菜游離小孢子培養(yǎng)及其植物再生研究[J].四川農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，17（2）：166-171.

作者簡(jiǎn)介：

羅永春（1972-）女，四川資中人，農(nóng)藝師，主要從事植物組織培養(yǎng)。