弓形蟲病診斷技術(shù)概述

摘要：弓形蟲病是一種分布廣泛、危害嚴(yán)重的人獸共患病。因此建立快速、準(zhǔn)確、特異的弓形蟲病診斷方法尤為重要，對該病在病原學(xué)、免疫學(xué)及分子生物學(xué)方面的診斷方法進(jìn)行了簡要概述。

關(guān)鍵詞：弓形蟲病；病原學(xué)診斷；免疫學(xué)診斷；分子生物學(xué)診斷

中圖分類號： S852.72+9 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）12-0019-02

弓形蟲是一種專性細(xì)胞寄生原蟲，具有廣泛的宿主群并在世界范圍內(nèi)流行，能引起人獸共患寄生蟲病。在畜牧業(yè)方面，弓形蟲會使懷孕母畜流產(chǎn)，豬感染弓形蟲會引起大批死亡。弓形蟲病不僅對畜禽危害嚴(yán)重，還是影響人類優(yōu)生優(yōu)育的一個重要生物因子。懷孕婦女感染弓形蟲，無論有無臨床癥狀，有一半左右可以發(fā)生母胎垂直感染，出現(xiàn)流產(chǎn)、死胎以及致使胎嬰先天性缺陷或畸形等。近年來，我國學(xué)者在弓形蟲病的流行情況、致病作用、診斷方法以及防制等方面都進(jìn)行了研究，現(xiàn)對該病的診斷技術(shù)進(jìn)行概述。

1 病原學(xué)診斷

1.1 組織學(xué)診斷

組織切片或體液涂片（如腦脊液、羊水或支氣管灌洗液） 查找弓形蟲速殖子可以診斷弓形蟲的急性感染。但在傳統(tǒng)染色的組織切片中查找速殖子較為困難，弓形蟲抗血清的過氧化物免疫酶標(biāo)記法被證明具有良好的敏感性和特異性，能夠成功檢測到AIDS患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中弓形蟲的存在。免疫過氧化物酶法也適用于未固定或用福爾馬林固定的石蠟組織切片。此外，還可通過對腦脊液的離心沉淀或組織進(jìn)行瑞氏-姬姆薩染色涂片。對炎癥灶鄰近的組織囊腫用上述方法檢查可進(jìn)行急性感染和潛伏感染的診斷。

1.2 動物實驗和細(xì)胞培養(yǎng)

動物接種是一種最為經(jīng)典、能直接確認(rèn)病原體存在的方法。孫新[1]用小鼠腹腔接種和THP21 細(xì)胞培養(yǎng)的方法對30例孕婦羊水進(jìn)行病原分離比較， 兩組共分離出6株弓形蟲，提示細(xì)胞培養(yǎng)可作為先天性弓形蟲病早期病原診斷的可行性方法。國外學(xué)者成功從1例眼弓形蟲病患者血液中分離出弓形蟲，成功傳代1年以上，并進(jìn)行動物腹腔接種。雖然這兩種方法結(jié)果可靠，但敏感性低、耗時長、易漏診和難于實際操作。

2 免疫學(xué)診斷方法

免疫學(xué)診斷是弓形蟲病調(diào)查、診斷的常用方法。檢測抗弓形蟲抗體或循環(huán)抗原的免疫學(xué)診斷方法主要有染色試驗（DT）、凝集試驗（AT）、酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、免疫膠體金技術(shù)等。

2.1 染色試驗（DT）

DT曾被視為是弓形蟲病特有的血清學(xué)檢測方法及最有價值的檢測手段，具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。但由于在進(jìn)行檢查時必須使用活的、有毒力的速殖子而存在巨大的危險性，限制了其應(yīng)用。隨后在此基礎(chǔ)上建立了免疫酶染色試驗（IEST），它是以玻片上的甲醛固定的弓形蟲蟲體作為抗原，與血清樣本中抗體反應(yīng)，加入酶標(biāo)二抗及底物，以蟲體周圍出現(xiàn)完整的淡黃色作為陽性標(biāo)準(zhǔn)。該法簡單、敏感、特異、快速，可在現(xiàn)場使用。趙恒梅等[2]用該法檢測11份陽性兔血清和34份弓形蟲病人的血清，陽性率分別為100%和94.1%，與血吸蟲病、肺吸蟲病、瘧疾等均無交叉反應(yīng)，與間接免疫熒光法（IFAT）無差異。

2.2 凝集試驗（AT）

2.2.1 直接凝集試驗（DAT） 此法簡便快速，陽性反應(yīng)出現(xiàn)時間比IHA早。試驗以甲醛固定的弓形蟲懸液作為抗原與被檢血清直接進(jìn)行反應(yīng)。在玻片上加不同稀釋度的試驗血清，混勻，幾分鐘后在顯微鏡下觀察，如發(fā)生凝集，則為陽性反應(yīng)。

2.2.2 間接血細(xì)胞凝集試驗（IHA） 主要優(yōu)點是簡便、快速、靈敏，已廣泛應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。陳義民等[3]建立了以弓形蟲滋養(yǎng)體（速殖子）抗原致敏綿羊紅細(xì)胞的IHA方法，應(yīng)用此試劑檢測人工感染弓形蟲的兔血清，首次檢測出抗體的時間為感染后7 d，檢出率為100%。在此基礎(chǔ)上張德林等[4]又創(chuàng)建了一種以弓形蟲代謝分泌抗原致敏羊紅細(xì)胞的IHA方法，用此方法制備的試劑較前者提前2 d檢出血清中的抗體，且在檢測結(jié)果上兩者的符合率100%。

除此之外，還有膠乳凝集試驗、反向IgM免疫吸附凝集試驗、碳粒凝集試驗以及在此基礎(chǔ)上發(fā)展起來的印度墨水免疫反應(yīng)等檢測方法。

2.3 間接熒光抗體試驗（IFAT）

IFAT是以完整死弓形蟲為抗原，采用熒光標(biāo)記的二抗檢測特異IgM和IgG。IFAT具有特異、敏感、快速、重復(fù)性好等優(yōu)點。但如有類風(fēng)濕因子、抗核抗體則存在非特異性染色，可引起假陽性反應(yīng)，同時判定結(jié)果易帶主觀性。

2.4 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）

ELISA是當(dāng)前診斷弓形蟲感染應(yīng)用最廣的技術(shù)。間接ELISA法測弓形蟲IgM抗體，發(fā)現(xiàn)急性病例檢出率較高，但類風(fēng)濕因子陽性者出現(xiàn)假陽性反應(yīng)。近年來，新發(fā)展的雙夾心法測IgM，是采用抗IgM抗體包板，樣本中的IgG、類風(fēng)濕因子及抗核抗體等均在第一步捕獲IgM步驟中被分離去，從而消除了非特異的干擾，提高了敏感性及特異性。

3 分子生物學(xué)診斷方法

聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase chain reaction， PCR ）是一種非常敏感、特異、高效、快速的分子生物學(xué)檢測方法。目前PCR方法有多重PCR、原位PCR、免疫-PCR和熒光定量PCR等，已經(jīng)逐步應(yīng)用于弓形蟲病的檢測。除此之外，DNA雜交技術(shù)也用于對弓形蟲的檢測，包括蟲種鑒定、某些基因片段的堿基序列分析及抗原表達(dá)、種群分類等；一些克隆化基因表達(dá)的融合蛋白也已用于弓形蟲病的檢測。由于分子生物學(xué)檢測方法對實驗室要求高，且診斷試劑價格較貴，不適用于在基層推廣。

近幾年，通過大量的實驗研究，弓形蟲病診斷研究方面已取得較大進(jìn)展，一些研究成果已經(jīng)或正在對弓形蟲病的防治產(chǎn)生積極影響。傳統(tǒng)的血清學(xué)方法由于操作簡單，仍然是基層動物防疫部門進(jìn)行檢測的首選方法，現(xiàn)代PCR方法雖大大改善了弓形蟲病的診斷，但仍存在很多問題。隨著免疫技術(shù)的發(fā)展及分子生物學(xué)、單克隆抗體的應(yīng)用，將使弓形蟲病的檢測技術(shù)達(dá)到簡易、微量、快速、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的目的，顯著提高診斷水平，使弓形蟲病的檢測方法達(dá)到更高層次。

參考文獻(xiàn)：

[1] 孫 新. 細(xì)胞培養(yǎng)和動物接種分離弓形蟲病原比較研究[J]. 蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報， 1996，21 （5）： 291-292.

[2] 趙恒梅，徐克繼，楊慧珍.免疫酶染色試驗診斷弓形蟲病的研究[J]. 中國人獸共患病雜志，1991，7（5）：13-14.

[3] 陳義民，李觀娣，李寶琛. 實驗弓形蟲病的間接血凝診斷試驗[J].中國獸醫(yī)科技，1980（4）：10-15.

[4] 張德林，李學(xué)瑞，杜重波. 用弓形蟲代謝分泌抗原制備間接血凝診斷試劑的研究[J].中國獸醫(yī)科技， 2003，33（9）：15-18.