淺談基層畜牧獸醫站實驗室常規ELISA檢測操作注意事項

摘要：介紹了實驗室常規ELISA試驗的基本原理、操作要領及注意事項，供基層畜牧獸醫站工作人員參考。

關鍵詞：ELISA試驗；實驗室診斷；操作注意事項

中圖分類號：S852.5+3 文獻標識碼：B 文章編號：1007-273X（2013）12-0069-02

近年來，隨著國家動物疫病檢測計劃的實施和地方動物疫病預防控制工作的科學化管理，獸醫實驗室發揮著越來越重要的作用。目前獸醫實驗室診斷主要分三大類：病毒學診斷、血清學診斷及細菌學診斷。細菌學與病原學檢測工作在基層實驗室開展得不多，使用最普遍的是血清學診斷，尤其是ELISA診斷試劑盒，一次可診斷幾十份血清，無論檢測抗體還是抗原，都十分方便、快速有效。對ELISA試驗的基本原理、操作要領及注意事項進行了介紹，供參考。

1 ELISA的基本原理與類型

ELISA是一種免疫測定技術。免疫測定技術是應用免疫學技術測定標本的方法。在臨床檢驗中主要通過抗原抗體反應檢測體液中的抗體或抗原性物質。ELISA既可用于測定抗體，也可用于檢測抗原。根據檢測目的和操作步驟的不同，有以下四種類型的常用方法：直接法、間接法、雙抗體夾心法、競爭法。

2 ELISA試驗的特點

ELISA試驗主要有以下幾個特點：①靈敏度高、特異性強；②方法快速、簡便；③重復性好；④自動化程度高，適合批量標準化檢測；⑤安全可靠。

3 ELISA試驗的操作要領[1，2]

3.1 樣品的采取和保存

3.1.1 樣品種類 體液、組織、分泌物和排泄物。

3.1.2 樣品要求 新鮮、無溶血、無沉淀、均勻。

3.1.3 樣品采取與保存 盡量避免溶血；血清標本的制備：非抗凝自然凝固1～2 h，3 000 r/min離心15 min；血漿標本的制備：使用含有抗凝劑的采血管采血，顛倒混勻放置一段時間后，3 000 r/min離心15 min；標本宜在新鮮時檢測，若5 d內檢測，可使用冰箱于2～8 ℃保存，超過1周時間測定，應于-20 ℃低溫凍存；反復凍溶會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存做多次檢測，宜少量分裝凍存。

3.2 試劑的準備

嚴格按要求準備試劑；使用新制的蒸餾水或去離子水；自配緩沖液應用pH計測量較正；冷藏試劑應平衡至室溫后使用；試劑盒中暫時不用的部分應及時放回冰箱。

3.3 加樣

盡量使用多道移液器；微量加樣器應注意保養并定期校正；加樣前應使溶液充分混勻，并將液體加在孔底，避免加在孔壁上部，注意不可出現氣泡。加樣時避免樣本濺出，如有樣本濺出孔外時，應用吸水紙輕輕拭干，并做相應記錄。加樣后微孔板應及時溫育，盡量縮短加樣后溫育前的等待時間。

3.4 保溫孵育

3.4.1 溫度 37 ℃、室溫（20～25℃）和4 ℃；溫度要恒定、準確。

3.4.2 保溫方式 水浴保溫時，ELISA板底應貼著水面，加蓋避免蒸發；保溫箱保溫時為避免蒸發，用濕盒或用塑料貼封紙覆蓋板孔；反應板不宜疊放。

3.5 洗滌

3.5.1 目的 清除殘留在板孔中未結合的物質；清除非特異吸附于固相載體的干擾物。

3.5.2 要求 洗滌要充分；排凈；避免干燥。

3.6 顯色和比色

3.6.1 顯色 顯色是酶促反應，溫度和時間應力求準確；顯色反應應避光進行。

3.6.2 比色 酶標板的放置要正確；要選用產物的敏感吸收波長；以空白孔調零或雙波長式測讀可減少誤差。

4 ELISA試驗的常見問題及分析

ELISA操作是需要非常細心的工作。操作者在進行ELISA操作前應該對試驗有充分的了解，并對預期結果十分清楚。實驗室ELISA 試驗失敗的原因有10%左右是由于水質量引起的，另外90%則是操作上的失誤引起的，包括未意識到的操作失誤，或者明知操作原則但想偷懶而未按正確要求操作；另外，還有少量失敗案例是由于設備的管理不當或設備狀況太差引起的[3]。

在大多數ELISA試驗中，最終都要通過酶標儀讀數。在得出的數據中可以重點關注陰陽對照的2組數值，這可以在一定程度上反映試驗的重復性和準確性。可以通過計算陰性對照組和陽性對照組各自的變異系數來反映試驗的重復性和準確性，如果變異系數小于20%則說明操作的重復性較好，操作較準確，反之則重復性較差，操作不當。也可以通過一個樣品的重復檢測來反映試驗操作的準確性，這樣可以盡可能排除操作方面的因素對試驗結果的影響，提高檢測的準確性。

參考文獻：

[1] 李純玲. 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）在畜禽飼養及疾病診斷中的應用[J]. 當代畜牧，2005（7）：20-22.

[2] 焦 奎，張書圣. 酶聯免疫分析技術及應用[M].北京：化學工業出版社，2004.

[3] 王海霞， 陳婷飛， 盧黎明， 等.寧波市基層獸醫試驗室試劑盒使用現狀調查[J].浙江畜牧獸醫，2008（6）：19-20.