葛根素對人牙周膜干細胞成骨分化的作用

[摘要]目的：探討葛根素對人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）成骨分化的影響。方法：向體外培養(yǎng)的hPDLSCs中分別加入0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作為實驗組，另設陽性對照組和空白組。MTT法檢測葛根素對hPDLSCs活性影響，采用免疫熒光法、堿性磷酸酶（alkaline phosphotase，ALP）試劑盒、茜素紅染色及qRT-PCR對葛根素作用后hPDLSCs生物學特性作初步觀察。結(jié)果：0.01mmol/L葛根素可明顯促進hPDLSCs增殖，免疫熒光染色顯示實驗組I型膠原蛋白（collagen-I，COL-I）和骨橋蛋白（osteopontin，OPN）均陽性表達；與空白組對比，實驗組誘導7天后ALP活性升高，14天后茜素紅染色見礦化結(jié)節(jié)形成，qRT-PCR檢測ALP和骨鈣蛋白（osteocalcin，OCN）分別在加藥后7天和14天表達上調(diào)。結(jié)論：葛根素能夠促進牙周膜干細胞向成骨細胞分化。

[關(guān)鍵詞]牙周膜干細胞；葛根素；成骨分化

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）10-1067-05

眾所周知，雌激素缺乏會增加患牙周病的危險度引起牙槽骨迅速吸收牙齒松動[1]。葛根素是從豆科植物野葛的干燥根中提取的一種異黃酮類化合物，可作為雌激素的替代藥物發(fā)揮雌激素樣作用[2]。文獻報道葛根素能夠促進臍帶間質(zhì)干細胞向成骨細胞分化[3]。人牙周膜干細胞（human periodontal ligament stem cells，hPDLSCs）具有多向分化潛能，在適當?shù)臈l件下，可分化為成骨細胞、成牙骨質(zhì)細胞、脂肪細胞及神經(jīng)元樣細胞[4]。本研究旨在探討葛根素對hPDLSCs成骨分化的影響，為臨床牙槽骨再生的防治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1實驗材料：葛根素（陜西天潤生化有限公司，HPLC≥98%），二甲基亞砜、胎牛血清、α-MEM培養(yǎng)基、胰酶、Dispase酶、膠原酶（Gibco，美國），免疫磁珠、磁力架（Dynal biotech，美國），STRO-1單克隆抗體、CD146單抗、抗波形絲蛋白單抗、抗廣譜角蛋白單抗、抗骨橋蛋白單抗（Novex，美國），抗I型膠原蛋白單抗、山羊抗鼠熒光二抗（Abcam，美國），山羊抗兔熒光二抗（Jackson，美國），地塞米松、維生素C、β-甘油磷酸鈉、茜素紅、MTT（Sigma，美國），ALP試劑盒（南京建成），DNAase試劑盒（Promega，美國），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，日本），qPCR試劑盒（Roche，瑞士）。

1.2 實驗方法

1.2.1 hPDLSCs的分離和培養(yǎng)：在供者知情同意的前提下，收集12～16歲因正畸拔除的雙尖牙，所選牙齒均無齲壞、根尖周疾病及牙周炎。參考以往的文獻[5-6]，將新鮮拔除的牙齒在超凈工作臺內(nèi)沖洗干凈后，仔細刮取根中1/3的牙周膜組織，加入1ml 6mg/ml的膠原酶和1ml 8mg/ml的Dispase酶（此為四顆牙用量）混勻37℃水浴消化1h左右，1000rpm離心5min后棄上清，細胞重懸于10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待人牙周膜細胞（human periodontal ligament cells，hPDLCs）傳至第三代，采用免疫磁珠法分離hPDLSCs：將約1×106/ml的hPDLCs與STRO-1單抗4℃孵育1h，與磁珠4℃孵育30min，在磁力架作用下篩選出STRO-1+hPDLCs并接種于6 孔板內(nèi)，37℃、5% CO2的孵箱中培養(yǎng)。

1.2.2 hPDLSCs的鑒定：將篩選出的STRO-1+hPDLCs制備成細胞爬片，免疫熒光法進行STRO-1 、CD146、波形絲蛋白（Vimentin）及角蛋白（Cytokertin）染色，陰性對照以PBS代替一抗，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.3 MTT法檢測葛根素對hPDLSCs活性的影響：將hPDLSCs按1×103/孔接種于96孔板，待細胞貼壁后分別更換為含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素的α-MEM培養(yǎng)基（每孔200μl），每組設5個復孔，同時設不含葛根素的空白對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h后， 各孔加入MTT 20μl，置37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h，棄上清液， 每孔加入DMSO溶液150μl，混勻后用酶標儀檢測其在570 nm 處的吸光度值。

1.2.4 葛根素對hPDLSCs成骨分化的影響

1.2.4.1 免疫熒光染色：分別取實驗組培養(yǎng)7天和14天的細胞制備爬片，免疫熒光法進行成骨標志COL-I及OPN染色，陰性對照以PBS代替一抗，未加葛根素組作為空白對照，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.4.2 ALP活性測定：將hPDLSCs接種于24孔板，待70%～80%匯合后，實驗組更換為含0.01mmol/L、0.1mmol/L、1mmol/L葛根素培養(yǎng)基，同時設空白組（不含葛根素的α-MEM培養(yǎng)基）和陽性對照組（成骨誘導液：含10%FBS的α-MEM、100nmol/L的地塞米松、0.05mmol/L的抗壞血酸、10mmol/L的 β-甘油磷酸鈉[7]），繼續(xù)培養(yǎng)7天后（每兩天更換培養(yǎng)基），按照ALP試劑盒說明書操作在酶標儀520nm波長處測定各孔的吸光度并計算出ALP濃度。

1.2.4.3 礦化結(jié)節(jié)形成檢測：將hPDLSCs接種于6孔板，待70%～80%匯合后，同上設置實驗組、空白組、陽性對照組，培養(yǎng)14天后，棄培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定15min，PBS（pH=4.2）沖洗2次，2%（w/v）茜素紅溶液在37℃孵育箱內(nèi)染色20min后PBS沖洗3次，鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)的形成情況。

1.2.4.4 qRT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達情況：將hPDLSCs接種于12孔板，待70%～80%匯合后，實驗組、空白組、陽性對照組更換相應培養(yǎng)液，分別在培養(yǎng)7天和14天后收集細胞并以TRIzol提取總RNA，用DNAase處理后測其在波長260nm和280nm處的吸光度比值，介于1.8～2.0純度的RNA用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。熒光定量PCR采用LightCycler480系統(tǒng)，步驟為：變性95℃ 60s，退火58℃ 30s，延伸72℃ 30s，共擴增40個循環(huán)。成骨相關(guān)基因引物及內(nèi)參基因GAPDH序列為：ALP引物序列：F：TTCAAACCGAGATACAAGCACT，R：GGGCCAGACCAA AGATAGAG；OCN引物序列：F：GCAGCCACCGAGACACCAT，R：AGAGCGACACCCTAGACCG；內(nèi)參基因GAPDH引物序列：F：AGGTCGGAGTCAACGGATTTG，R：AGGCTGTTGTCATAC TTCTCAT。

1.3 統(tǒng)計學分析：采用SPSS16.0 軟件對組間進行單因素方差分析，并比較各組間的差異，P<0.05即認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 hPDLSCs分離和培養(yǎng)：本實驗采用酶消化法從人牙周膜中分離出原代hPDLCs進行培養(yǎng)，3～7天后見細胞爬出，呈梭形成纖維細胞狀，兩周左右可達80%匯合。用免疫磁珠法篩選出hPDLSCs，接種于24孔板，約兩周長滿孔底80%。hPDLSCs形態(tài)與hPDLCs相似，為梭形、多角形或不規(guī)則形，呈旋渦狀或放射狀排列（圖1A）。篩選前后分別進行細胞計數(shù)，結(jié)果顯示STRO-1+細胞約占細胞總數(shù)的2%。

2.2 hPDLSCs鑒定：免疫熒光法檢測示篩選出的細胞STRO-1、CD146 均呈陽性表達（圖1B、C），提示其具有干細胞特性。Cytokertin呈陰性表達，Vimentin呈陽性表達（圖1D），說明篩選出的細胞為中胚層來源的間充質(zhì)細胞，無外胚層來源的細胞污染。

2.3 葛根素對hPDLSCs增殖影響：MTT檢測結(jié)果顯示，hPDLSCs在0.01mmol/L、0.1mmol/L和1mmol/L葛根素作用24h后，各實驗組OD值均大于空白組，且0.01mmol/L組差異有統(tǒng)計學意義（圖2）。提示0.01mmol/L葛根素有促進hPDLSCs增殖作用，而其他兩濃度組對細胞未產(chǎn)生毒性作用。

2.4 葛根素對hPDLSCs成骨分化的影響

2.4.1 免疫熒光染色：將實驗組hPDLSCs進行免疫熒光染色，結(jié)果顯示成骨表面標志COL-I和OPN分別在葛根素作用7天和14天后呈陽性表達（圖3A、B），空白組及PBS陰性對照組呈陰性表達，提示葛根素可使hPDLSCs向成骨細胞分化。

2.4.2 ALP活性：如圖4示，與空白組相比，葛根素各濃度組在加藥7天后細胞內(nèi)ALP水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學意義，與陽性對照組相比差異不顯著，提示葛根素可促進hPDLSCs成骨分化。

2.4.3 礦化結(jié)節(jié)形成：各組細胞培養(yǎng)14天后進行茜素紅染色，結(jié)果顯示，實驗組及陽性對照組均見大量礦化結(jié)節(jié)形成，其中0.1mmol/L葛根素組與陽性對照組的礦化結(jié)節(jié)大小及數(shù)量相當，但0.01mmol/L和1mmol/L葛根素組的礦化結(jié)節(jié)數(shù)少于陽性對照組（圖3C～G）。

2.4.4 RT-PCR：RT-PCR分別檢測早期和晚期成骨相關(guān)基因ALP和OCN。ALP表達變化為：在加藥第7天時各濃度葛根素組和陽性對照組均呈上調(diào)趨勢，其中0.1mmol/L組上調(diào)顯著，為空白對照組的4.8倍；在加藥第14天時各濃度葛根素組的ALP表達量與空白對照組相比未見明顯變化。OCN表達變化為：在加藥第7天時各組OCN表達量沒有明顯變化；在加藥第14天時各濃度葛根素組和陽性對照組OCN表達量均顯著上調(diào)，其中0.1mmol/L組上調(diào)最為顯著，為空白對照組的5.6倍（圖5）。

3 討論

牙周膜干細胞是牙周組織中的成體干細胞，自從2004年Seo[6]成功地將其分離出來，它便以多向分化潛能及牙周高相關(guān)性成為牙周組織工程理想的種子細胞，近幾年來已成為牙周再生醫(yī)學研究領(lǐng)域的熱點課題[8]。研究表明PDLSCs上表達雌激素受體（ER-α、ER-β），且受雌激素的調(diào)控[9]，進一步研究發(fā)現(xiàn)ER-β是雌激素調(diào)控牙周膜細胞增殖與成骨分化的主要受體[10]。ZhangB等從反面證明卵巢切除大鼠牙周膜干細胞成骨分化能力受損[11]。

雌激素替代療法被認為是一種有效的防治骨質(zhì)疏松促進骨形成的方法，但是長期使用雌激素會極大地提高乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等的發(fā)病率[12]。而植物類雌激素能夠有效地彌補了這一缺陷，如黃酮類中草藥淫羊藿苷在一定濃度范圍內(nèi)可促進人牙周膜細胞增殖及骨向分化[13]。同屬黃酮類的藥物葛根素亦能夠發(fā)揮雌激素樣作用即促進骨密度增加和骨礦沉積[14]。近年來，國內(nèi)越來越多的學者開始探索葛根素在骨代謝方面的作用。蔡花[3]等研究表明葛根素對臍帶間充質(zhì)干細胞增殖及成骨分化有促進作用；李斌斌[15]等將葛根素分別作用于成骨細胞和破骨細胞發(fā)現(xiàn)葛根素通過抑制骨吸收刺激骨形成來調(diào)控骨代謝，其中抑制骨吸收的效果較強；金為旭[16]將葛根素注射于拔牙窩周圍發(fā)現(xiàn)其能夠抑制剩余牙槽嵴的吸收并保存牙槽嵴的高度。但關(guān)于葛根素對hPDLSCs成骨分化的調(diào)控作用尚未見報道。本實驗采用免疫磁珠法成功地分離出hPDLSCs，并通過免疫熒光染色檢測證實其表達干細胞表面標志物STRO-1和CD146。當加入不同濃度的葛根素時，MTT結(jié)果顯示隨著濃度的增高細胞增殖率遞減，0.01mmol/L組明顯促進hPDLSCs的增殖，而其他兩組與空白組無顯著差異，以往的研究已發(fā)現(xiàn)葛根素在低濃度時促進而超過1.2mmol/L即開始抑制細胞增殖[2-3]，本實驗所選三個濃度均未對hPDLSCs造成毒性作用。含有β-甘油磷酸鈉、維生素C、地塞米松的成骨誘導液是間充質(zhì)干細胞向成骨細胞分化所必需[7]，可誘導hPDLSCs分化為成骨細胞，這一過程大致分為兩個階段，即基質(zhì)成熟（成骨早期）和礦化完成（成骨晚期）。分化早期伴隨著PDLSCs增殖減弱，基質(zhì)成熟的標志物--ALP逐漸增高，到了晚期基質(zhì)開始礦化，OCN表達升高，礦化結(jié)節(jié)大量形成，如果早期細胞過度增殖則無法順利進入下一階段[17]。本實驗以成骨誘導液作為陽性對照，觀察葛根素對PDLSCs成骨分化的作用。加藥作用7天后，ALP活性升高， RT-PCR檢測進一步證實早期ALP表達顯著上調(diào)。加藥作用14天后，與空白組對比，OCN表達明顯上調(diào)，茜素紅染色亦可見大量礦化結(jié)節(jié)形成。免疫熒光染色檢測顯示成骨表面標志COL-I及OPN均陽性表達。對比分析本次實驗組的三個濃度，0.1mmol/L葛根素組成骨表現(xiàn)強于其他兩濃度組，分析可能是因為0.01mmol/L的葛根素明顯促進hPDLSCs的增殖阻礙其向下一階段即成骨分化發(fā)展，而1mmol/L的葛根素對hPDLSCs的增殖和分化均產(chǎn)生了輕微的抑制作用，但具體的作用機制還有待進一步的研究。

本研究首次表明：在適當?shù)臐舛茸饔孟?，葛根素可有效地促進hPDLSCs向成骨細胞分化，為其應用于口腔臨床防治牙槽骨吸收提供了理論基礎。

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[收稿日期]2013-04-13 [修回日期]2013-05-10

編輯/張惠娟