ADSCs復合HA促進裸鼠背部軟組織血管化的實驗研究

[摘要]目的：探討ADSCs復合HA促進裸鼠背部軟組織血管化的實驗研究 方法：根據所選材料不同，將實驗分為三組，A組為ADSCs復合HA，B組為ADSCs復合脂肪顆粒，C組為單純ADSCs，分別將3組試劑隨機注射到10只裸鼠皮下，每只裸鼠各注射3個點，3個月后獲取相應標本，觀察相應指標。結果：①大體觀察：A組組織塊吸收最少，B組組織塊吸收較少，C組組織塊基本吸收最多；②濕重測定：A組明顯高于B、C組，且差異有統計學意義（P<0.01），B組高于C組，差異有統計學意（P<0.05）；③存活率比較（%）：A組明顯高于B、C組，且差異有統計學意（P<0.01），B組高于C組，差異有統計學意義（P<0.05）；④微血管密度（MVD）：A組明顯高于B、C組，差異有統計學意義（P<0.01），B組高于略高于C組，差異有統計學意義（P<0.01）；結論：HA作為生物支架復合ADSCs可加速裸鼠軟組織血管化的形成，為整形美容外科脂肪干細胞移植中生物支架的選擇提供理論依據。

[關鍵詞]透明質酸；脂肪干細胞；生物支架；血管化；整形美容外科

[中圖分類號]R318 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）10-1076-03

自體脂肪移植是理想的修復軟組織缺損的方法，但移植的脂肪組織成活率低，限制了其在臨床上的推廣應用[1-2]。脂肪干細胞生物支架復合物是指在脂肪干細胞移植過程中加入相應生物支架，可用來促進移植部位的血管化作用，來提高游離組織的存活率。本研究主要探討透明質酸（hyaluronic acid，HA）作為生物支架與脂肪來源干細胞（adipose tissues derived stem cells，ADSCs）混合后對裸鼠背部軟組織血管化的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗試劑及主要儀器：II型膠原酶、DMEM培養液、血清、pbs液、胰蛋白酶、堿性成纖維細胞生長因子、組織勻漿機、純水系統、恒溫CO2培養箱、低溫臺式離心機、精密天平、恒溫搖床、倒置相差顯微鏡、超凈工作臺、培養瓶、離心管、脂肪抽吸針等吸脂手術器械。支架材料：透明質酸鈉（Sigma，美國）；脂肪組織來源于臨床吸脂病人抽取組織。抽取為雙下肢股外側及股后側脂肪，患者對本實驗知情并自愿捐獻自體脂肪組織100ml用于本研究。

1.1.2 實驗動物：裸鼠10只，3W，平均體質量15g，雄性，由河南科技大學醫學院動物實驗中心提供，實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 實驗設計及方法

1.2.1 干細胞的分離與培養：膠原酶消化脂肪，分離收集原代ADSCs置DMEM培養液傳代，收集第3代細胞作為種子細胞。ADSCs按4×105有核細胞/ml細胞密度接種于培養瓶內，常用的75mm塑料培養瓶接種細胞3×107左右，加入低糖DMEM+10%FBS培養液培養，傳代收集第3代細胞作為種子細胞，DII熒光標記。

1.2.2 干細胞一生物支架復合物制備、植入和取材： 根據所選材料不同，將實驗分為3組，A組將ADSCs按1：1比例與HA混合，B組將ADSCs按1：1比例與脂肪顆粒混合，C組為單純ADSCs，分別將3組試劑按0.2ml（0.2cm3）隨機注射到10只裸鼠皮下，每只裸鼠各注射3個點，3個月后獲取相應標本，并行免疫組化染色。

1.2.3 觀察：①大體觀察：肉眼觀察各組織塊間體積的大小；②濕重：沿移植物被膜外分離，完整取出移植物，立即以電子天平稱濕重；③存活率：存活率=術后復合組織塊濕重/術前復合組織塊濕重；④微血管密度（MVD）：各實驗組根據CD31免疫組化染色結果，免疫組化染色圖片其陽性表達區域一般為黃色或棕黃色，因此采用Image-Pro Plus 圖像分析軟件進行半定量分析，每組選取6張（×200）不同視野的免疫組織化學染色圖片比較各組微血管生成情況，并根據圖像分析軟件測量結果進行相關統計分析。

1.2.4 統計學方法：數據采用 SPSS18.0統計軟件進行分析。采用LSDt檢驗進行兩兩比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 實驗結果

2.1大體觀察：各實驗組體積變化呈現一定的規律性，不同實驗組變化出現較大的波動，A組組織塊吸收最少，B組吸收較少，C組組織塊吸收最多。術后A、B、C、D四組組織塊體積分別為0.172cm3、0.147cm3、0.109cm3：A組組織塊明顯大于B、C組。

2.2 濕重測定：A、B、C分別為：（0.076±0.006）g、（0.052±0.007）g、（0.021±0.002）g，A組明顯高于B、C組，且差異有統計學意義（P<0.01），B組高于C組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.3 存活率比較（%）：A、B、C組成活率分別為：（86.00±4.10）%、（73.50±5.17）%、（62.00±4.16）%。A組明顯高于B、C組，且差異有統計學意義（P<0.01），B組高于C組，差異有統計學意義（P<0.05）。

2.4 微血管密度（IOD）：A、B、C組分別為88.19±11.21、56.23±10.08、21.22±10.72，D組為：65.24±7.71，見圖1A、B、C。A組明顯高于B、C組，且差異有統計學意義（P<0.01），B組高于C組，差異有統計學意義（P<0.05），見表1、表2。

3 討論

自2001年[3]發現ADSCs以來，科研人員使用不同的誘導因子將其誘導分化為不同的組織細胞。Zuk等[3]最早發現它可以向脂肪細胞、成骨細胞分化。隨后的研究表明ADSCs不僅可以分化為中胚層的細胞系，還可以分化為外胚層的神經細胞以及內胚層的血管內皮細胞等。ASCs取材容易、來源豐富，與骨髓間充質干細胞（Bone marow derived stromal/stem cells， BMSCs）一樣具有自我更新能力、活力持久及多向分化潛能等干細胞特征，并且具有穩定生長和增殖、促進組織修復的能力，促進移植物的血管化，提高存活率。ASCs在已經在整形外科領域已經應用較多，如自體脂肪移植、促進創面愈合等，因此，關于ASCs的研究成為醫學研究的熱點之一[4]，其已成為組織工程中較常用的理想的種子細胞[5]。

非動物源性的透明質酸（hyaluronic acid，HA）是一種天然的高分子多糖，是世界上公認的保濕劑，HA很容易發生降解，透明質酸具有非抗原性，很少引起炎癥和異物反應因其無致敏性、容易獲得且本身就是細胞基質成分，作為組織工程支架具有廣闊的前景[3]。之前已經有研究發現透明質酸鈉可作為生物支架并與脂肪干細胞混合，并具有一定的協同作用[7]。

故本實驗應用組織工程技術，將透明質酸鈉做為支架材料，與 ADSCs混合成復合物，探討其在小鼠軟組織中促進其血管化的研究，筆者發現，與無支架的單純脂肪干細胞或與以脂肪顆粒為支架的復合物相比，脂肪干細胞-透明質酸鈉復合物在裸鼠軟組織中血管化作用比較明顯，其血管數量較多、結構較典型，為脂肪干細胞-透明質酸鈉復合物可加速小鼠軟組織血管化的形成及其血管化程度提供客觀數據，從而證明透明質酸鈉作為組織工程中生物支架的可行性，為臨床脂肪干細胞移植中生物支架的選擇提供理論依據，并為整形美容外科提供一種新的修復材料。

[參考文獻]

[1]Patrick CW Jr.Adipose tissue engineering： the future of breast and soft tissue reconstruction following tumor resection[J]. Semin Surg Oncol，2000，19（3）：302-311.

[2]楊波，沈宏亮，徐志飛，等.脂肪組織來源干細胞可促進脂肪移植物的存活率[J].中國組織工程研究， 2012，16（19）：3492- 3494.

[3]Zuk PA，Zhu M，Mizuno H，et a1.Multilineage cells from human adipose tissue：Implications for cell-based therapies[J].Tissue Eng，2001，7（2）：21 1-228.

[4]趙建輝，易成剛，郭樹忠，等.脂肪來源干細胞的基礎研究進展[J].中國美容醫學，2011，20（3）：512-514.

[5]Sumi M，Sata M，Toya N，et al.Transplantation ofadipose stromal cells，but notmature adipocytes，augments ischemia-induced angiogenesis[J].Life Sciences，2007，80（26）：559-565.

[6]Sumi M，Sata M，Toya N，et al.Transplantation ofadipose stromal cells，but notmature adipocytes，augments ischemia-induced angiogenesis[J].Life Sciences，2007，80（26）：559-565.

[7]Awad Wicldmm MQ，Leddy.Chondrogenic differentiation of adipose-derived adult stem cells in agarose alginate andgelatin scaffolds[J].Biomaterials，2004，25：3211-3222.

[收稿日期]2013-03-23 [修回日期]2013-05-02

編輯/張惠娟