蝦青素對HaCaT細胞氧化應激損傷的保護作用

[摘要]目的：探討蝦青素對長波紫外線（UVA）輻射誘導的HaCaT細胞氧化應激損傷的保護作用。方法：采用人角質形成細胞HaCat細胞構建體外模型，MTT法測定細胞活力，酶生化法測定細胞超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）的活性和丙二醛（MDA）的含量。結果：蝦青素能提高受UVA輻射的HaCaT細胞的增殖活力，提高胞質SOD和GSH-px的活性，降低細胞內MDA的含量。結論：蝦青素對受UVA輻射的HaCaT細胞氧化應激損傷有一定的保護作用。

[關鍵詞]蝦青素；長波紫外線；HaCaT細胞

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）11-1175-03

引起皮膚光老化的主要環(huán)境因素是陽光中的紫外線輻射（UVR），其中長波紫外線（UVA，波長 320～400nm）是引起皮膚老化的最主要因素，它能穿透皮膚角質層到達真皮層，引起真皮層膠原纖維減少和彈力纖維變性，出現特征性的光老化改變[1]。蝦青素是一種含氧的類胡蘿卜素，具有抗氧化功能，能有效清除氧自由基[2]。本實驗主要探討蝦青素對人角質形成細胞（HaCaT細胞）受UVA輻射損傷后的保護作用及其可能的作用機制。

1材料和方法

1.1 主要試劑：蝦青素：純度≥98%，美國SIGMA公司；胎牛血清：杭州四季青生物工程有限公司；胰蛋白酶：北京索萊寶科技有限公司；DMEM高糖培養(yǎng)基：美國GIBCO公司；四甲基偶氮唑藍（MTT）粉：美國Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）檢測試劑盒和考馬斯蘭蛋白測定試劑盒：南京建成生物工程研究所。

1.2 細胞來源：HaCaT細胞購自武漢大學細胞典藏中心。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)和分組：采用胎牛血清培養(yǎng)HaCaT細胞，傳代時用胰蛋白酶進行消化。將細胞培養(yǎng)至指數生長期時，隨機分為6組：空白對照組、UVA損傷組、UVA+0.1μg/L蝦青素組、UVA+1μg/L蝦青素組、UVA+10μg/L 蝦青素組、UVA+100μg/L蝦青素組。

1.3.2 MTT法測定HaCaT細胞增殖活性：將培養(yǎng)至指數生長期的HaCaT細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200μl，密度為104個/ml。按上述方法進行分組，每組4個復孔，加入不同濃度蝦青素。孵育12h后倒去培養(yǎng)基，使用PBS液沖洗3次，再次加入PBS液，采用強度為18J/cm2的UVA進行照射（除空白對照組外）。照射后倒去PBS液，繼續(xù)用原培養(yǎng)基培養(yǎng)12h后，各孔加入MTT（濃度5mg/ml）20μl，孵育4h，吸去上清，加入200μl二甲基亞砜（DMSO），室溫振蕩15min。選擇波長490nm在酶聯免疫檢測儀上測定各孔的吸光值。

1.3.3 SOD、GSH-px活性測定和MDA含量測定：仍按上述方法對細胞進行分組及UVA輻射處理，取經UVA輻射后繼續(xù)培養(yǎng)12h的細胞，用胰蛋白酶消化，離心5min（1000r/min），吸去上清，冷無菌雙蒸水調節(jié)細胞濃度，按照考馬斯亮蘭蛋白測定試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）測試盒、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）測試盒及丙二醛（MDA）測定試劑盒的說明書要求進行操作，分別于595nm、550nm、412nm、532nm處測定各組細胞的OD值，按公式計算出各組樣本的蛋白含量、SOD活性、GSH-px活性以及MDA含量。

1.4 統(tǒng)計學分析：采用SPSS13.0軟件，計量資料用（x±s）表示，對所得結果采用單因素方差分析。

2 結果

2.1 蝦青素對HaCaT細胞活力的影響：與空白對照組比較，除UVA+100μg/L 蝦青素組外，其余各組細胞的增殖活力（用OD值表示）明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與UVA損傷組比較，除UVA+0.1μg/L 蝦青素組外，其余各組細胞的增殖活力明顯提高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。此外，除UVA+1μg/L蝦青素組和UVA+10μg/L蝦青素組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義外（P>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表1。

2.2 蝦青素對HaCaT細胞抗氧化應激作用的影響

2.2.1 SOD活性測定結果分析：與空白對照組比較，各組細胞的SOD活性均明顯降低，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與UVA損傷組比較，除UVA+0.1μg/L 蝦青素組外，其余各組細胞的SOD活性均明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；此外，除UVA+ 1μg/L 蝦青素組和UVA+10μg/L 蝦青素組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義外（P>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2.2 GSH-px活性測定結果分析：與空白對照組比較，各組的GSH-px活性均有所下降，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與UVA損傷組比較，除UVA+0.1μg/L 蝦青素組外，其余各組的GSH-px活性均明顯上升，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。此外，除UVA+1μg/L 蝦青素組和UVA+10μg/L 蝦青素組兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義外（P>0.05），其余各組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。

2.2.3 MDA含量測定：與空白對照組比較，其余各組的細胞MDA含量明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；與UVA損傷組比較，其余各組的細胞MDA含量明顯減少，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；此外，余下各組間比較差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

皮膚衰老通常分為內源性老化（自然老化）和外源性老化（主要為光老化）。暴露部位皮膚的老化約90%是由紫外線的光老化（photoaging）作用引起。由于UVA對皮膚的穿透能力高于UVB，能穿透至真皮，引起膠原纖維和彈力纖維的損傷，故UVA在皮膚光老化發(fā)病中的作用日益受到重視[3-4]。UVA尤其是UVA1（340～400nm）照射可使皮膚細胞產生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）[5-6]，當產生的ROS超過細胞所能消除的能力時，氧化與抗氧化平衡被打破，氧化應激發(fā)生，造成細胞凋亡、甚至死亡[7-8]。目前已有較多研究證實某些物質成分對UVA引起的光損傷具有保護作用，如黃芪、人參、杜仲、絞股藍、紅景天等，其作用機制主要通過抗氧化作用來實現[9]。而一些研究表明部分抗氧化劑如Ectoin（一種埃及水域植物）、茶葉提取物、番茄紅素、水龍骨屬植物提取物、N-乙酰基半胱氨酸等具有一定的預防皮膚光老化作用[10-12]。

蝦青素作為一種類胡蘿卜素，廣泛存在于自然界的海洋動物體、藻體及部分陸生植物體內，其尤以抗氧化、防止心血管疾病、提高免疫力和抗癌作用突出[13]。蝦青素能淬滅單線態(tài)氧，并有效清除氧自由基，類似維生素E，為脂溶性抗氧化劑，但其抗氧化活性高于VE，也高于β-C、玉米黃素、葉黃素和角黃素等類胡蘿卜素[14]。然而蝦青素在皮膚光老化中的作用研究較少，僅有個別研究指出某種含有蝦青素成分的脂質體配方外用，對紫外線引起的皮膚損傷具有保護作用[15]。而關于蝦青素對UVA輻射后角質形成細胞氧化應激損傷的保護作用及其可能相關機制尚未見報道。本實驗在建立UVA輻射人角質形成細胞模型的基礎上，探討蝦青素對體外培養(yǎng)角質形成細胞受到UVA輻射損傷后的保護作用及其可能作用機制。

MTT法是一種檢測細胞存活和生長的方法，本研究結果顯示除大劑量蝦青素（100μg/L）組外，經UVA輻射后HaCaT細胞的增殖活力明顯下降；而與UVA損傷組比較，除最小劑量蝦青素（0.1μg/L）組外，其余各組細胞增殖活力明顯提高，提示：蝦青素對人角質形成細胞受UVA輻射損傷具有防護作用，劑量越大，細胞的增殖活力越強。SOD和GSH-px是機體廣泛存在的兩種重要的抗氧化酶，可以保護角質形成細胞免受紫外線介導的細胞損傷。MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一，常用來反映機體內脂質過氧化的程度，從而間接地反映出細胞損傷的程度。本研究結果表明，UVA輻射可抑制人角質形成細胞SOD和GSH-px的活性， 導致細胞MDA含量明顯增加，但在預先給予蝦青素后，可使細胞SOD和GSH-px的活性明顯升高， 細胞MDA含量明顯減少，并且在劑量為100μg/L時，效果最好。說明蝦青素對人角質形成細胞受到UVA輻射后產生的氧化應激損傷具有保護作用，并在高濃度時達最佳效果。

綜上可見，UVA輻射對HaCaT細胞具有損傷作用，而蝦青素對受UVA輻射的HaCaT細胞氧化應激損傷具有一定的防護作用，其機制可能是通過清除氧自由基，提高抗氧化酶的活性來實現的。由此我們推斷，蝦青素在一定程度上可以對抗光老化導致的皮膚衰老。但本實驗僅為角質形成細胞的體外實驗，尚需進一步通過活體研究來證實此保護效應。

[參考文獻]

[1]Kang S，Fisher GJ，Voorhees JJ.Photoaging and topical tretinoin：therapy，pathogenesis，and prevention[J].Arch Dermatol，1997，133（10）：1280-1284.

[2]Williams RJ， Spencer JP， Rice-Evans C. Flavonoids：antioxidants or signaling molecules[J]？ Free Radic Biol Med，2004，36（7）：838-849.

[3]Wenk J，Brenneisen P，Meewes C，et a1.UV-induced oxidative stress and photoaging[J].Curr Probl Dermatol，2001，29：83-94.

[4]Burke KE.Photoaging：the role of oxidative stress[J].G Ital Dermatol Venereol，2010，145（4）：445-459.

[5]Valencia A，Kochevar IE.Noxl-based NADPH oxidase is the major source of UVA-induced reactive oxygen species in human keratinocytes[J].J Invest Dermatol，2008，128（1）：214-222.

[6]Wenk J，Btenneisen P，Meewes C，et a1.UV-induced oxidative stress and photoaging[J].Curr Probl Dermatol，2001，29：83-94.

[7]Emri G，Horkay I，Remenyik E.The role of free radicals in the UV-induced skin damage[J].Photoaging Orv Hetil，2006，147（16）：731-735.

[8]Stadtman ER.Role of oxidant species in aging[J].Curr Med Chem，2004，11（9）：1105-1112.

[9]蘇躍，徐麗敏.光老化的中醫(yī)藥防治研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2011，20（7）：1185-1187.

[10]Uliasz A，Spencer JM.Chemoprevention of skin cancer and photoaging[J].Clin Dermatol，2004，22（3）：178-182.

[11]Buenger J， Driller H.Ectoin： an effective natural substance to prevent UVA-induced premature photoaging[J]. Skin Pharmacol Physiol，2004，17（5）：232-237.

[12]劉仲榮，楊軍，楊慧蘭，等. 抗皮膚老化化妝品活性成分的研究進展[J].中國美容醫(yī)學，2005，14（3）：362-365.

[13]惠伯棣.類胡蘿卜素化學與生物化學[M].北京：中國輕工業(yè)出版社，2005：156-68.

[14]Luczaj W，Waszkiewicz E，Skrzydlewska E，et al. Green tea protection against age-dependent ethanol-induced oxidative stress[J].J Toxicol Environ Health A，2004，67（7）：595-606.

[15]Hama S，Takahashi K，Inai Y，et al.Protective effects of topical application of a poorly soluble antioxidant astaxanthin liposomal formulation on ultraviolet-induced skin damage[J]. J Pharm Sci，2012，101（8）：2909-2916.

[收稿日期]2013-04-08 [修回日期]2013-05-26

編輯/張惠娟