脂肪來源干細胞的特點及其在牙周組織重建中的應用潛力

由于重度牙周炎、口腔腫瘤、外傷導致的牙周組織嚴重缺損，不僅影響患者行使口腔功能，還影響美觀，給患者造成巨大痛苦。傳統的牙周基礎治療雖然針對牙周病病因，可以阻止疾病發展，卻無法恢復牙周組織應有的形態和功能。植骨術及植骨材料應用于牙周組織的重建，雖有一定療效，但牙槽骨吸收、手術失敗的案例十分常見。牙周組織工程細胞以其神奇的再生與分化能力逐漸成為牙周組織重建的研究焦點。盡管胚胎干細胞（embryonic stem cells，BSCs）比其他成體干細胞更具優勢，但其涉及倫理問題，被各國政府所禁止。目前，常用的牙周組織工程種子細胞主要有牙周膜干細胞（periodontal ligament stem cells，PDLSCs）和骨髓基質細胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）。PDLSCs來源于牙周膜，是牙周組織重建的理想種子細胞，但其數量有限，較難用于大面積缺損的修復。BMSCs是來源于骨髓基質的一種間充質細胞，在不同的誘導條件下，能向成骨細胞、成軟骨細胞、成纖維細胞等中胚層組織細胞分化，是骨缺損修復的重要細胞，具有來源豐富，較好的增殖、分化及成骨能力，性能穩定等特點。不足之處是取材時有一定的創傷和痛苦。脂肪來源干細胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是來源于脂肪組織的間充質細胞，與BMSCs同源，誘導分化能力也與BMSCs類似，在不同條件下能夠分化為多種細胞。它有增殖能力強、來源廣泛等特點，有望成為牙周缺損修復的新型種子細胞。本文從脂肪來源干細胞的特點入手，探討ADSCs在牙周組織重建中的應用前景。

1 ADSCs的概念

2001年，Zuk等[1]首先通過脂肪抽吸術從脂肪組織中分離出形態上類似成纖維細胞的一組細胞，這些細胞被稱為脂肪來源干細胞（ADSCs）。后期的研究證實ADSCs與BMSCs同源，都是多能干細胞（multipotent stem cells，MSCs），均能在恰當的誘導下，分化為脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、肌細胞等多種終末細胞，并具有跨胚層、跨系分化的潛能。ADSCs不僅擁有BMSCs的絕大多數特性，而且還具有取材廣泛的優勢，這使得ADSCs在組織工程學和再生醫學中成為研究的熱點。

2 ADSCs的特點

2.1 來源廣泛，無倫理限制：近年來，因肥胖而進行選擇性吸脂的患者逐年上升。吸脂術是一種安全有效又被廣為接受的手術，手術風險小，患者痛苦少，且抽吸的脂肪液屬于廢物利用。皮下脂肪、網膜脂肪和白色脂肪組織中存在大量的ADSCs。因此，從這些部位吸出的脂肪組織可用于提取ADSCs，這在臨床應用中同樣是重要的自體細胞來源，且不受倫理道德方面的限制。

2.2 產量巨大：一次吸脂手術一般可獲得超過200ml的脂肪組織，每100ml都能獲得大約2×108個有核細胞[2]。可以產生超過O.5×106的干細胞，相當于20ml骨髓中BMSCs數量的40倍。在成纖維細胞集落形成單位（colony-forming unit-fi- broblast，CFU-F）試驗中表明，脂肪組織中干細胞數目至少是骨髓的500多倍[3]。此外，脂肪組織比骨髓中所含的間充質干細胞（mesenchymal stem cell）比率大[2]。因此，在相同條件下，ADSCs比BMSCs更具臨床應用潛力。

2.3 增殖能力強： ADSCs細胞周期分析顯示，GO/G1期的細胞占69%，S期的細胞占24%，G2/M期的細胞占8%[4]，表明擴增后的ADSCs處于相對靜止狀態和原始狀態的細胞較多，細胞仍保持干細胞特性。傳代培養中，ADSCs平均倍增時間為60h，并表現低水平衰老，第1代細胞沒有出現衰老現象，第10代低于5%的細胞出現衰老，第15代仍低于15%，這表明ADSCs體外增殖能力很強[5]。

2.4 具有多向分化潛能：ADSCs是屬于MSCs范疇，具有多向分化的特性。它不僅具有成脂潛能，通過特定的誘導可以分化為骨細胞、軟骨細胞，肌細胞、血管內皮細胞等[6-7]。牙周組織修復過程中，牙周骨質、牙周膜及其血管的再生有賴于ADSCs上述一些分化特性，從而提供了一種牙周組織修復的新途徑。

2.5 可分泌多種細胞因子：ADSCs具有分泌功能，其分泌多種可促進血管再生的細胞因子[8]，如：血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、粒細胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）、間質源性因子-1α、肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor，HGF）。ADSCs也能通過旁分泌作用促進成纖維細胞分泌I、Ⅲ型膠原和纖連蛋白，促進皮膚表皮細胞的成熟以利于創面愈合和瘢痕縮小[9]。其分泌的白細胞介素、HGF和TGF-β1能共同激活B、T淋巴細胞，起到抗炎作用[10]。ADSCs分泌的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）能夠抑制細胞免疫反應，降低ADSCs免疫原性[11]。此外，ADSCs還通過一系列復雜的分泌機制調控細胞凋亡，激活成纖維細胞使其重塑細胞外基質，從而起到更新老化皮膚、保持上皮完整性的作用[10]。

3 ADSCs在牙周組織重建中的應用潛力

牙周組織重建[12]是一個較為復雜的生物學目標，包括形成新的牙骨質、牙周膜和牙槽骨，重新向牙冠方向恢復齦-牙結合，最終達到解剖和功能的恢復。ADSCs的上述特點有望在牙周組織重建的各個環節發揮作用。

3.1 ADSCs具有重建牙周骨質的潛力：許多實驗研究表明，ADSCs可作為骨組織修復的理想種子細胞。在地塞米松、甘油三磷酸與抗壞血酸磷酸酯的誘導下，ADSCs可以有效地向成骨細胞分化[13]。Dragoo等[14]比較了腺病毒介導骨形態發生蛋白-2（bone morphogenic protein-2，BMP-2）轉染ADSCs、BMSCs成骨誘導分化的能力，結果發現ADSCs能夠產生更多的細胞外鈣鹽沉積。將ADSCs植入生物支架材料，可聯合用于重新構建受損的骨質。葉眉等[15]將人ADSCs與經PRP孵育的納米羥基磷灰石/膠原復合培養7天后，環境掃描電鏡觀察細胞在支架材料上附著增殖情況。結果顯示：ADSCs能在支架上充分地附著伸展。這說明，納米羥基磷灰石/膠原與ADSCs具有良好的生物相容性，可聯合用于修復骨缺損。有研究者[16]將ADSCs接種于多種支架后植入裸鼠模型中，發現ADSCs在體內分化為成骨細胞并形成類骨質，且具有對骨缺損區進行修復的潛能。

基因工程的應用也為ADSCs的應用提供了思路。有學者[17]將經過BMP-2基因修飾的ADSCs后植入股骨缺損模型，結果顯示缺損部位較對照組明顯修復。更令人興奮的是，在骨缺損的修復過程中，不僅可以產生充足的礦化骨質，并且有形成髓腔的趨勢，這也為ADSCs在骨重建方面的應用提供更有利的支持[18]。牙槽骨作為全身骨組織的一部分，其組織結構、修復過程與全身骨組織有很多相同之處。我們可以考慮將ADSCs通過誘導骨分化、與支架材料結合及與基因工程相結合的方法應用于其重建，相關研究極具價值。

3.2 ADSCs具有修復受損牙周膜纖維的潛力：牙周組織的重建很大程度上取決于牙周膜的重建。牙周膜中膠原纖維不斷改建，實現膠原的合成和分解的動態平衡，主要歸功于成纖維細胞，因而牙周膜纖維的再生有賴于成纖維細胞數量和功能的恢復。折濤等[19]通過實驗證實ADSCs培養上清液能促進成纖維細胞的增殖、遷移及抑制凋亡發生，從而為修復受損的牙周膜纖維提供了可能。

近來，ADSCs 在肌腱與韌帶修復方面的報道不斷增加。Little等[20]將ADSCs 接種于韌帶來源的基質支架進行誘導，結果顯示ADSCs 可分化為韌帶細胞，且效果明顯優于傳統膠原支架。Kryger 等[21]比較了ADSCs、BMSCs、韌帶細胞、鞘成纖維細胞修復韌帶缺損的能力，發現ADSCs 的增殖速度快于其他細胞，為韌帶修復提供了更多的細胞來源。Tobita等[22]將ADSCs與從近交系大鼠獲得的富血小板血漿（PRP）一同注入受損的大鼠牙周組織中，8周后通過組織學和免疫組化分析，顯示實驗組出現牙槽骨、牙骨質和牙周膜樣結構，從而為ADSCs修復牙周膜提供了直接證據。牙周膜纖維結構與肌腱、韌帶相似，其成分都是膠原纖維束組成的致密結締組織，功能上都是連接相鄰的骨組織。上述研究成果為ADSCs在牙周膜纖維再生中的應用帶來了巨大希望。

3.3 ADSCs具有重建牙周血液循環的潛力：ADSCs有助于重建血液循環。實驗表明[23]，與BMSCs和內皮前體細胞移植僅形成毛細血管不同，ADSCs在移植后還形成類似于結構完整的大血管樣結構，所以ADSCs在形成新血管方面具有更大的優勢。Amos等[24]利用免疫熒光標識ADSCs，注射至微循環障礙模型的裸鼠的腸系膜內，觀察結果表明：經ADSCs處理后，實驗組新血管密度較空白對照組明顯增加，從而表明ADSCs能夠向脈管系統分化，同時通過某種機制促進血管新生。之前我們提到過，ADSCs分泌大量的血管生長因子和抗凋亡因子，包括血管內皮生長因子和肝細胞生長因子等，可用于促進血管再生。有學者[25]對無免疫應答的小鼠分別肌注/靜注ADSCs和BMSCs，成功促進其后肢缺血區的血液再灌注，并且發現ADSCs效果優于BMSCs。目前尚無報道將ADSCs應用于牙周微血管的重建，但以上證據表明，ADSCs用于重建牙周血液循環十分可行。

3.4 ADSCs具有促進牙周創面愈合的潛力：ADSCs在創傷愈合方面的研究剛剛起步，但早期研究已顯示出其加速愈合的重要潛力。Kim等[26]發現用ADSCs處理的小鼠傷口愈合更快，且沒有肉芽或表皮異常增生，并明確了ADSCs通過細胞-細胞接觸和分泌誘導的旁分泌激活機制促使人成纖維細胞增殖，從而大大加速了受損皮膚的再上皮化。Ebrahimian等[27]證實ADSCs促進傷口愈合，有分化為角蛋白細胞的潛質，能分泌角蛋白生長因子（KGF）和血管內皮生長因子（VEGF）。而KGF在維持上皮細胞形態和促進傷口愈合中起主導作用[28]。Trottier等[29]發現角蛋白細胞、皮膚成纖維細胞和ADSCs在無任何合成的或外源支架存在的情況下，可以在離體環境中生成新的皮膚代用品，并通過大鼠實驗證實ADSCs有促進皮膚再生和整合的作用。牙周組織的愈合，尤其是牙齦的愈合狀況直接影響牙周手術的質量，而愈合的速度同樣為患者所關注。ADSCs在皮膚愈合過程中的杰出表現為牙周組織優質、高效愈合提供了新思路。

4 優勢與不足

綜上所述，結合文獻[20-31]，將ADSCs應用于牙周組織重建的優勢總結如下：①獲取方法簡單，不會給患者造成太大傷害，患者樂于接受；②脂肪組織來源廣泛，脂肪組織中干細胞含量豐富；③ADSCs增殖能力強，培養相對容易；④具有多分化潛能，可用于牙周多種組織的修復與再生；⑤分泌生長因子，產生多種效應；⑥可降低免疫排異反應；⑦避免了胚胎干細胞所面臨的醫學倫理學問題。

盡管脂肪來源干細胞較其他組織工程種子細胞有很多自身優勢，但其在牙周組織工程中的研究才剛剛起步，相關文獻報道尚屬空白。主要問題有對脂肪來源干細胞本身認識的不足以及牙周組織重建的自身特點。對ADSCs認識的不足[32-35]面臨以下幾方面需要解決的問題：①能否采用更加有效的表面標記物以提取高純度的ADSCs？②離體和在體條件下如何控制ADSCs的增殖和分化？關鍵因子有哪些？③ADSCs能夠促進多種器官功能是因為ADSCs的分化潛能還是旁分泌作用？④能否找到更好的培養介質及培養方法以避免污染和病原接觸？⑤ADSCs異體移植成功遠期效果如何？結果是否長期可靠？此外，牙周組織的重建有與全身其他組織相同之處，亦有其自身特點。牙周組織重建理想的愈合方式是原來已暴露于牙周袋內的病變牙根面上有新的牙骨質形成，其中有新生的牙周膜纖維埋入，這些纖維束的另一端埋入新形成的牙槽骨內，形成新的有功能性的牙周支持組織。也可將其稱為形成了新附著（new attachment），新形成的結合上皮位于治療前牙周袋底的冠方[12]。牙齦的附著位置、齦緣形態等同樣為美觀要求較高的患者所關注。而ADSCs在牙周組織中的基礎研究目前十分有限。若盲目應用，結果可能會有差異。尚需建立標準化模擬牙周組織微環境的實驗條件，長期、系統的研究數據以及多學科的交叉運用，以促使ADSCs在臨床上安全、可控、有效的應用。或許，ADSCs目前并不是牙周組織修復的首選細胞，但它在各方面的出眾表現使我們對其充滿信心。隨著對ADSCs及其在牙周組織工程中的應用研究不斷深入，ADSCs將在不遠的未來為牙周缺損患者帶來美麗的笑容。

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[收稿日期]2013-04-14 [修回日期]2013-05-27

編輯/李陽利