苦參堿對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖的影響

[摘要]目的：探討苦參堿（Matrine，簡稱Mat）的藥理活性，研究苦參堿對人增生性瘢痕成纖維細胞增殖的抑制作用，為皮膚損傷后出現的增生性瘢痕的治療提供理論支持及實驗依據。方法：將不同濃度梯度Mat作用于體外培養的增生性瘢痕成纖維細胞，測MTT反應的A0值及LDH值，利用通過流式細胞儀檢測其細胞周期、DNA相對含量，用免疫組織化學檢測Mat用藥前后的細胞核內增殖性抗原（proliferatingcell nuclear antigen，PCNA）的表達。結果：增生性瘢痕成纖維細胞在一定范圍內呈劑量依賴性增殖抑制，但LDH值無明顯改變；DNA相對含量無明顯變化，PCNA表達逐漸減弱。結論：Mat 在體外能明顯抑制增生性瘢痕成纖維細胞的增殖而不引起細胞壞死性改變，但對DNA含量無明顯影響。

[關鍵詞]苦參堿；增生性瘢痕成纖維細胞

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）12-1291-03

組織損傷修復是人體自我保護的一個正常病理過程，而過度修復則會出現組織纖維化，造成增生性瘢痕的出現，從而影響組織、器官的正常功能，導致機體出現異常病變，這種疾病導致的結果是使機體的外形改變以及造成某些功能的喪失和障礙。目前醫學工作者將創傷愈合、瘢痕形成的機制及其治療作為外科研究的重點，花費了大量精力在臨床研究上，因此，在這一方面取得了不小的成果[1]。苦參類生物堿是以苦參堿為代表，化學結構相似的一類生物堿物質[1]。近年來，國內外在研究、使用苦參類生物堿的過程中發現其多方面的藥理活性及生物學功能。在目前的研究中，苦參類生物堿是我們多年來使用的增生性瘢痕軟化膏的主要活性成分，其臨床效果明顯，能明顯抑制瘢痕的增生，使增生性瘢痕縮小且軟化。所以說，苦參類生物堿對于皮膚的損傷修復具有一定的療效，尤其對增生性瘢痕成纖維細胞的抑制作用非常明顯，對于它的作用機制，需要做進一步研究，從而更好的研發出作用療效較高的治療藥物。為此，我們深入探討其作用機制，本次試驗的對象為體外培養的增生性瘢痕成纖維細胞，通過觀察及收據分析，深入研究苦參堿對增生性瘢痕成纖維細胞的細胞周期及DNA含量的影響，從而得出結論。

1 材料和方法

1.1 一般材料：①試驗所用藥品苦參堿標準品由中國藥品、生物制品檢定所購買所得，性狀為為水溶性粉劑，溶于三蒸水中，濃度為50mg/ml，并且生物堿溶液要經過過濾除菌，最后制成備用溶液儲備起來；②DMEM，胰蛋白酶，由美國Gibco公司生產；③胎牛血清（ fatal bovineserum，FBS）：由杭州四季青生物工程材料研究所生產；④DNA染色試劑：由美國COULTER公司生產。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養與藥物配制：從2012年9月收治的皮膚損傷患者中隨機選取8例，這些受試患者年齡為5到33歲之間，平均年齡28歲，其中男性5例，女性3例，患者病程均為1～2.5年，如沒有特殊皮膚病經歷，不考慮患者的其它疾病。對這些患者進行組織提取，取下的增生性瘢痕組織，放入培養皿中用于細胞的培養。首先，這些培養皿必須進行無菌消毒，然后將取下的組織在培養皿中漂洗，去除組織上的血污及脂肪，確保瘢痕組織絕對干凈，表面沒有其他組織成分[2]。接下來，將洗干凈的瘢痕組織用消毒過的剪刀剪碎成約1mm3的小塊。制備培養液時，首先將DMEM導入器皿中，然后加入100ml/L胎牛血清、100U/ml的青霉素和100g/L鏈霉素，苦參堿標準品以1：0.001比例溶解于DMEM培養液中。將塊狀瘢痕組織培養于制備好的DMEM培養液中，放入CO2 培養箱中培養，將溫度調控在37℃。之后等細胞長大，當細胞長成致密單層后，取出培養的細胞，用2.5g/L胰蛋白酶消化，然后以1∶3的方式傳代，并將第3～9代細胞用于本次實驗。

1.2.2 乳酸脫氫酶（LDH） 的測定取對數生長期的細胞，以105/ml細胞含量接種于24孔培養板培養，加條件培養基分為實驗組和對照組，實驗組為加500μg的苦參堿溶液，含量為300μg/ml；對照組為加500μl的DMEM 溶液。對這兩組溶液繼續培養24h，取上清液，用全自動生化分析儀測LDH活性值。

1.2.3 MTT比色法測定細胞增殖狀況首先制成細胞懸液，然后將細胞接種于96孔培養板上培養，培養24h后，加入不同質量濃度Mat。同時另外培養兩組細胞，將培養的細胞分為兩組對照組，一組對照組不加Mat，一組對照組只加培養基，這組為空白對照組。將實驗組每組設8個復孔，加入藥品等待48h之后加5mg/ml的MTT溶液 20L，繼續放置4h，之后離心，去除上層清液，然后加入DMSO200μl，避光振蕩10min。之后開始測其細胞增殖情況，采用全自動酶標儀測定各孔吸光度（A0）值，然后參考文獻，根據所得數據測其細胞生長抑制率，從而得出增生性瘢痕成纖維細胞的增殖抑制情況。

1.2.4 DNA相對含量測定得到的細胞樣品用離心機離心，然后去除上清液。然后進行細胞洗滌，采用PBS洗滌。再加1mlPBS和2ml無水乙醇，然后將細胞冷藏，上流式細胞儀檢測。

1.2.5 PCNA檢測 取對數生長期細胞于6孔培養板內培養，于CO2培養箱內培養24h后，分2組，分別加入苦參堿培養液和空白培養液；24h后，用甲醇和丙酮固定，晾干24h后，中性樹脂粘片，PBS沖洗振蕩三次，加入1%過氧化氫，甩干加E抗，4℃放置10h，復溫1h，PBS沖洗振蕩三次。甩干加I抗，37℃放置1h，PBS沖洗振蕩3次，甩干，DAB顯色。

2 結果

2.1 LDH測定結果加入苦參堿作用24h后培養上清液中LDH與對照組無顯著性差異（P>0.05），見表1，說明藥物含量≤300μg/ml無細胞毒作用。

2.2 Mat對成纖維細胞的細胞毒作用成纖維細胞經Mat處理48h后，經MTT 法檢測，活細胞數明顯減少，半數抑制濃度IC50值為1.25mg/ml，與對照組相比差異顯著，見表2。

2.3 對細胞DNA含量及細胞周期的影響苦參堿對DI影響不明顯，各時期細胞分布為G0～G1期細胞略有降低，S期細胞比例明顯減少，G2～M期細胞比例明顯增多；與對照組相比有顯著差異（P<0.01）。見表3。

2.4對PCNA表達的影響將對照組和和苦參堿組的成纖維細胞進行PCNA的測定，測定結果為對照組成纖維細胞的胞核多呈深棕黃色，而苦參堿組的成纖維細胞的胞核呈現多重顏色，且顏色深淺不一，顏色深淺與用藥濃度呈負相關關系，隨著用藥濃度的增加，顏色逐漸變淺。詳見圖1，2。

3 討論

多年以來，醫學工作者從來都沒有停止過對治療增生性瘢痕的有效方法的探究，盡管現在出現了一些治療手段，比如傳統的治療方法，包括手術切除，類固醇激素、抗代謝藥、免疫抑制劑治療及放射療法等等。但這些方法應用于臨床之后，患者出現很多不良反應，恢復效果不理想，因此，這些治療方法并不為人們所熱衷，醫學工作者通過多年努力，發現中藥治療可以作為治療增生性瘢痕的有效途徑一直在尋找治療瘢痕的有效途徑。故從中藥中提取出療效確切、副作用小的對抗增生性瘢痕的藥物具有重要的臨床意義[3]。從中藥苦參中提取的苦參類生物堿是以苦參堿為代表的、化學結構為四環喹嗪啶類稠合體的一類生物堿。醫學工作者通過大量的臨床試驗，證明苦參堿能抑制人增生性瘢痕成纖維細胞的增殖，從而具有治療瘢痕增生的皮膚性疾病的作用。苦參堿類化合物因為其獨特的化學結構，被人們所充分關注，對于成纖維細胞有著重要的藥理作用，值得我們進一步探究。

[參考文獻]

[1]湯蘇陽，蔡寶仁，黃高升.中醫藥治療瘢痕的研究進展[J].中國美容醫學，2000，9（6）：469.

[2]李曉靜，孟剛，寧金龍，等.瘢痕微血管構筑對瘢痕形成發展及臨床防治的基礎研究[J].現代康復，2001，10（1下）：44-45.

[3]李丹，王平全，張楠森.苦參類生物堿的研究進展及臨床應用[J].中草藥，1996，27（5）：308.

[收稿日期]2013-04-23 [修回日期]2013-06-03

編輯/張惠娟