Bcl—2、NF—KB在腮腺腺樣囊性癌中的表達及臨床意義

[摘要]目的：探討Bcl-2和NF-KB在腮腺腺樣囊性癌中的表達及意義。方法：應用免疫組化SP法檢側49例腮腺腺樣囊性癌和20例正常腮腺組織中Bcl-2和NF-KB的表達情況，統計學分析采用χ2檢驗，P<0.05判斷為具有顯著性差異。結果：Bcl-2和NF-KB的表達強度顯著高于正常腮腺組織（P<0.05），Bcl-2、NF-KB的表達與病理無關（P>0.05），與TNM分期有關，Bcl-2和NF-KB兩者存在正相關性（P<0.05，Kappa=0.387）。結論：在腮腺腺樣囊性癌的發生、發展過程中NF-KB通過上調Bcl-2的表達發揮作用。

[關鍵詞]腮腺；腺樣囊性癌；Bcl-2；NF-KB

[中圖分類號]R622 Q813.1 [文獻標識碼]A [文章編號]1008-6455（2013）12-1302-05

腮腺腺樣囊性癌是一種常見的口腔頜面部惡性腫瘤，在腮腺惡性腫瘤的發病率中位居第二位，它的發病原因及機理不清[1]。該腫瘤的強浸潤性、嗜神經侵襲性和極易早期發生血行轉移的生物學行為導致了較差的預后，據統計術后10年生存率約20%，15年生存率只有10%左右[2]。隨著醫學研究的不斷深入，專家學者們發現不僅細胞過度增殖可以引起腫瘤的發生，由細胞凋亡相關基因調控的細胞凋亡過程出現異常也可以引起腫瘤的發生[3]。Bcl-2是細胞凋亡相關基因的一個典型代表，也是當前細胞凋亡研究的熱點之一，它通過延緩細胞增殖周期抑制細胞凋亡，進而促進腫瘤形成。NF-KB是具有多向轉錄調節作用的細胞核蛋白因子，不僅與細胞凋亡關系密切，而且與腫瘤形成有關。Bcl-2又是NF-KB的下游調節靶基因。因此，本研究采用免疫組化SP法分別檢測Bcl-2和NF-KB在腮腺腺樣囊性癌中的表達情況，探討兩者在腮腺腺樣囊性癌發生發展中的生物學意義和相互關系，從而為該腫瘤的發生及發展提供有價值的標志物。

1 材料和方法

1.1 標本來源

1.1.1 實驗組：選取1999～2012年山西醫科大學第一醫院和山西省晉中市第一人民醫院手術切除的腮腺腺樣囊性癌病理科存檔蠟塊49例，男性22例，女性27例。年齡21～85歲，平均年齡51.75歲。篩狀型20例、管狀型18例、實體型11例（WHO世界衛生組織 2007年涎腺腫瘤分類法）。I期4例、II期17例、III期21例、IV期7例（UICC國際抗癌聯盟 2002年TNM分期）。病例納入標準：①臨床資料保留完整；②患者術前均未經任何抗癌治療；③均行根治性手術；④全部經過回訪，回訪時間最長術后10年，最短術后7個月。

1.1.2 對照組：選取自山西省晉中市第一人民醫院非腮腺腫瘤手術切除的20例正常腮腺組織標本。

1.2 主要試劑來源及實驗方法：實驗所用一抗均為即用型抗體，分別為兔抗人Bcl-2蛋白單克隆抗體（購自北京中杉）、鼠抗人Bax蛋白單克隆抗體（購自北京中杉）、兔抗人NF Kappa B/p50蛋白多克隆抗體（購自福州邁新）。免疫組化采用通用二步法（SP法），操作過程嚴格按照試劑盒說明書進行：石蠟切片脫蠟、水化，PBS沖洗三次，每次4～5min。每張切片滴加3%過氧化氫液，阻擋內源性過氧化物酶，室溫下孵育10～15min，PBS沖洗三次，每次3～5min。切片加入抗原修復液中，微波爐加熱，保持溫度在92℃～98℃持續10～15min。取出容器，室溫冷卻20～30min，PBS沖洗。再滴加一抗，室溫下孵育60min，PBS沖洗三次，每次3～5min。每張切片繼續滴加二抗，室溫下孵育30～60min，PBS沖洗三次，每次3～5min。每張切片滴加新鮮配置的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10min，蒸餾水沖洗，蘇木素染色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固。

1.3 結果判定：免疫組化染色標準參照抗體使用說明書：光鏡下觀察，免疫組化染色陽性細胞的胞漿為棕黃色或棕褐色，呈均勻染色或顆粒狀。結果評估：以40×10倍顯微鏡計數5mm x10mm網格微尺內的陽性和陰性細胞數。隨機計數5個高倍視野，求出平均每個高倍視野網格內陽性細胞百分率，陽性細胞數<25%或胞漿不著色為陰性（-）；陽性細胞數25%～50%或胞漿淺棕黃色為弱陽（+）；陽性細胞數50%～70%或胞漿棕黃色為中等陽性（++）；陽性細胞數70%以上或胞漿棕褐色為強陽性（+++）。

1.4 統計學分析：應用電子計算機統計軟件SPSS16.0，對數據采用χ2檢驗，P<0.05判斷為具有顯著性差異。

2 結果

2.1 Bcl-2免疫組化結果：49例腮腺腺樣囊性癌標本中33例Bcl-2出現陽性染色，染色主要定位于癌細胞胞漿內，染色強度分布不均勻，部分呈顆粒狀；20例正常腮腺組織中腺泡全部無染色，有6例導管系統的管腔上皮細胞胞漿出現弱陽性染色，1例導管管腔上皮細胞胞漿出現中等陽性染色，染色分布均勻，兩組差別有統計學意義（P<0.05）（見表1）。在病理類型的表達中Bcl-2在篩狀型、管狀型、實體型的總陽性表達率分別為55.0%、72.22%，81.82%，呈現遞增趨勢，而中、強陽性表達率分別為40.0%、66.67%、27.27%，結果顯示Bcl-2在分化好的篩狀型和管狀型出現中、強陽性表達率高于分化差的實體型，而實體型以弱陽性表達為主，但 Bcl-2在病理類型的陽性表達統計學分析無顯著性差異（P>0.05） （見表2）。Bcl-2在TNM臨床分期的I、II期陽性表達率85.71%明顯高于111、IV期的53.57%，I、II期中、強陽性表達率76.19%也明顯高于111、IV期的25.0%，研究結果顯示Bcl-2總陽性表達率和表達強度隨著腫瘤TNM分期的增加呈現下降趨勢，Bcl-2在TNM臨床分期的I、II期和111、IV期經統計學比較有顯著性差異（P<0.05）（見表3）。

2.2 NF-KB免疫組化結果：49例腮腺腺樣囊性癌標本中34例NF-KB出現陽性染色，染色主要定位于癌細胞胞漿，少部分定位于細胞核，染色較均勻；20例正常腮腺組織中腺泡全部陰性染色，有7例導管系統出現弱陽性染色，陽性染色部位定位于管腔上皮細胞胞漿中，染色分布均勻，統計學分析兩組差別有顯著性差異（P<0.05）（見表4）。在病理類型的表達中NF-KB在篩狀型、管狀型、實體型的總陽性表達率呈現緩慢上升趨勢，而NF-KB在分化好的篩狀型和管狀型中、強陽性表達率高于分化差的實體型，NF-KB在病理類型的表達統計學分析無意義（P>0.05）（見表5）。NF-KB在TNM臨床分期的I、II期陽性表達率明顯高于111、IV期， I、II期中、強陽性表達率也明顯高于111、IV期，NF-KB在TNM臨床分期的I、II期和111、IV期經統計學分析有顯著性差異（P<0.05）（見表6）。

2.3 NF-KB與Bcl-2在腮腺腺樣囊性癌表達的相關性：本研究中發現33例Bcl-2陽性的病例中，NF-KB陽性27例；16例Bcl-2陰性的病例中，NF-KB陰性9例。統計學分析Bcl-2和NF-KB在腮腺腺樣囊性癌的表達有顯著性差異（P<0.05），且兩者之間存在正相關關系（Kappa=0.387）（見表7）。

2.4 Bcl-2、NF-KB蛋白表達鏡下所見見圖1～8。

3 討論

Bcl-2由Tsujimoto等[4]1985年在人類濾泡型B細胞淋巴瘤染色體t[14-18]易位斷裂點發現的，主要功能是抑制細胞凋亡，但機制尚不明確，可能和通過多種方式影響細胞內線粒體凋亡途徑有關[5]。

Bcl-2在多種腫瘤中的表達已經得到證實，如：非小細胞肺癌[6]、卵巢癌[7]、膽管癌[8]等。Bcl-2在涎腺腺樣囊性癌的研究國內外文獻報道鮮見且研究結果不一致，如：劉鋒等[9]在47例涎腺腺樣囊性癌的研究中發現Bcl-2參與了涎腺腺樣囊性癌的發生，且與癌組織分化程度和惡性度有關，而Carlinfante G等[10]在21個涎腺腺樣囊性癌的研究中發現Bcl-2與病理類型、臨床分期及預后均無相關性。本研究發現Bcl-2在腮腺腺樣囊性癌組的陽性表達率明顯高于正常腮腺組，具有統計學意義，結果表明 Bcl-2參與了腮腺腺樣囊性癌的發生。在病理類型的表達中，Bcl-2在分化好的癌細胞中以中、強陽性表達為主，在分化差的癌細胞中以弱陽性表達為主，似乎參與了癌細胞的分化過程，但統計學分析無意義。Bcl-2陽性表達率I、II期明顯高于111、IV期，Bcl-2在 I、II期以中、強陽性表達為主，111、IV期以弱陽性表達為主，經統計學檢驗TNM臨床分期有顯著性差異，表明Bcl-2參與了腮腺腺樣囊性癌的發展過程。本實驗中，Bcl-2陽性表達強度隨著腫瘤惡性程度的增高逐漸下降，分析原因可能為機體細胞發生突變前，Bcl-2接收到異常信號，發生過度表達，延緩細胞生長周期，細胞逃避凋亡，壽命延長，數量增加，加上基因突變，最終癌變。隨著癌細胞的積累和增多，晚期癌細胞生長活力逐漸下降、各種癌基因劇增，Bcl-2表達反而受抑，本研究推測Bcl-2可能在腫瘤的早中期發揮了主要作用，且與腫瘤的發展關系密切，同時也驗證了De Vicente JC等[11]提出的Bcl-2指標逐漸降低可以作為癌細胞進入晚期的一個重要預警信號這一觀點。本研究提示對Bcl-2進行檢測可以及時反應腫瘤的惡性程度。

NF-KB是由Sen等[12]1986年在鼠成熟B淋巴細胞和漿細胞核提取物中發現的一類具有多向轉錄調節作用的細胞核蛋白因子。這個家族成員分為兩大類：一類包括前體蛋白p105、p100等，它們的C末端含有錨蛋白重復序列，在ATP依賴的蛋白酶水解過程中裂解為成熟的p50和p25。另一類是RelA（P65）、RelB、C-Rel等。NF-KB家族成員相互結合形成不同的NF-KB二聚體，NF-KB（p50/p65）是其中一個主要的異源二聚體，也是當前研究最多的核轉錄因子，它通過信號傳導通路參與炎性介質釋放、細胞凋亡及腫瘤形成等多種病理生理過程[13]。NF-KB信號傳導通路由NF-KB、NF-KB內源性抑制劑IkB和核轉錄因子抑制劑蛋白激酶復合體（IκB Kinase，IKK）家族組成，其中IKK由具有催化活性的IKKα、IKKβ和具有調節功能的IKKγ組成，在靜息狀態下，p50/p65與IκB在細胞質中結合形成二聚體，處于無活性狀態，當細胞受到外界因素刺激后，IKKβ亞單位發生激活，IKKα的Ser32和Ser36位點被磷酸化，磷酸化的IKKα在蛋白水解酶復合體作用下被成功降解，p50/p65與基因上的KB位點重新結合，p50/p65活化發揮作用，與此同時，細胞內IκB的合成又被重新啟動，新合成的IκB與p50/p65形成二聚體，p50/p65失活，NF-KB返回細胞質被重新利用，反復循環，發揮作用[14]。

已證明NF-KB在胃癌、非小細胞肺癌、胰腺癌、甲狀腺癌以及黑色素瘤等多種惡性腫瘤中存在陽性過度表達[15]。NF-KB在腮腺腺樣囊性癌的研究國內外文獻非常罕見，在涎腺腺樣囊性癌的研究也相當少見，由于樣本量較少，研究結論尚不統一。Zhang J等[16]發現NF-KB在裸鼠涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞系和低轉移細胞系均出現了陽性過度表達，且NF-KB在前者的表達明顯高于后者。Wang XF等[17]研究發現在裸鼠涎腺腺樣囊性癌高轉移細胞系和低轉移細胞系使用5-氟尿嘧啶（5-FU）抗癌治療后NF-kappaB p65陽性表達明顯下調。Zhang B等[18]指出少數文獻報道NF-KB與涎腺腺樣囊性癌抗凋亡和病理過程有關，但機理不清。Zhang JL等[19]在80例涎腺腺樣囊性癌的研究中發現NF-kappaB p65在癌細胞胞質和胞核中出現陽性表達，在正常涎腺腺泡胞漿也有陽性染色，NF-kappaB p65與腫瘤臨床分期、復發、轉移等有關。本研究發現NF-KB在腮腺腺樣囊性癌組的陽性表達率明顯高于正常腮腺組的陽性表達率，提示NF-KB參與了腮腺腺樣囊性癌的發生。NF-KB在腮腺腺樣囊性癌篩狀型、管狀型、實體型總陽性表達率呈現緩慢上升趨勢，但在篩狀型與管狀型中強陽性表達明顯高于實體型，提示NF-KB可能參與了癌細胞的分化，但統計學處理無顯著性差異。在TNM臨床分期的表達有顯著性差異，提示NF-KB與腮腺腺樣囊性癌的發展有關。

現已證明Bcl-2的調節位點上含有NF-KB的結合位點[13]。Tamatani[20]等也證實阻斷NF-KB信號傳導通路可減少下游抗凋亡蛋白Bcl-2的表達。NF-KB與Bcl-2在腮腺腺樣囊性癌抗凋亡相關性的研究國外報道罕見，國內未見報道。本研究發現Bcl- 2和NF- KB在腮腺腺樣囊性癌的發生、發展過程中密切相關，且兩者之間存在正相關關系。推測在腮腺腺樣囊性癌發生和發展過程中刺激因素先激活NF-KB信號傳導通路，NF-KB繼而使下游抑制細胞凋亡基因Bcl-2表達增強，Bcl-2通過使癌細胞長期處于G1期而延長了其增殖周期，進而發揮抑制細胞凋亡作用。當腫瘤進入晚期后，NF-KB和Bcl-2表達受到抑制，可能在其他因素的參與下腫瘤持續惡化直至患者死亡。

總之，通過本課題的研究我們推測NF-KB信號傳導通路參與了Bcl-2的抑制細胞凋亡過程，但有關NF-KB調節Bcl-2抑制細胞凋亡的確切機制還需要進一步的研究。

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[收稿日期]2013-05-06 [修回日期]2013-06-20

編輯/張惠娟