海南山蒼子揮發(fā)油GC-MS 分析及抗腫瘤活性研究

于長江，宋小平，張 鑫，韓長日*，朱林華*

1海南師范大學(xué)“省部共建-熱帶藥用植物化學(xué)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2 海南師范大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，海口 571127

山蒼子(Litsea cubeba)是我國特有香料植物，別名山胡椒、木姜子，為樟科木姜子屬的落葉灌木或小喬木，是一種極具綜合利用深加工價(jià)值的資源［1］。山蒼子根、莖、葉和果實(shí)均可入藥，是一味傳統(tǒng)的中藥材，具有抗菌、抗過敏等功效，可用于治療風(fēng)寒感冒、勞倦乏力、虛寒型胃痛等疾病。山蒼子油在防治害蟲、殺菌防霉及防治作物病害等方面具有突出優(yōu)點(diǎn)，發(fā)展前景廣闊［2］。山蒼子芳香油中富含的檸檬醛是合成紫羅蘭酮、甲基紫羅蘭酮、二氫大馬酮等的原料，也可用于配制草莓、蘋果、檸檬等水果型食用香精，檸檬醛在工業(yè)上有著廣泛的應(yīng)用范圍。

海南是個(gè)天然香料大寶庫，尤其是各種亞熱帶香料獨(dú)具優(yōu)勢(shì)。海南的山蒼子資源非常豐富，每年6～7 月果實(shí)累累，但目前未進(jìn)行開發(fā)利用［3］。本實(shí)驗(yàn)研究海南山蒼子芳香油的化學(xué)成分，測(cè)試其抗腫瘤活性，為海南山蒼子在醫(yī)藥上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。同時(shí)采用分子蒸餾技術(shù)分離山蒼子芳香油，研究山蒼子油各組份的抗腫瘤活性，提高山蒼子芳香油的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，促進(jìn)海南山蒼子的開發(fā)利用。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料

山蒼子于海南省采摘，室內(nèi)陰干保存，經(jīng)海南師范大學(xué)宋小平教授鑒定，樣品保存于海南師范大學(xué)“省部共建-熱帶藥用植物化學(xué)”教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室材料庫。人肺腺癌細(xì)胞(SPCA-1)、人肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、人胃癌細(xì)胞(GSC-7901)和人白血病細(xì)胞(K562)由中科院上海生物所提供。細(xì)胞用含10%胎牛血清、100 μg/mL 青霉素、100 μg/mL 鏈霉素、0.2% NaHCO3的RPM-I 1640 培養(yǎng)液，于37 ℃、5% CO2飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 儀器與試劑

二氧化碳超臨界萃取儀:杭州華黎泵業(yè)有限公司;分子蒸餾儀:德國瑞達(dá)有限公司;7890-5975 氣質(zhì)聯(lián)用儀:美國安捷倫公司;高壓滅菌鍋:日本森展企業(yè)有限公司;倒置顯微鏡:重慶光學(xué)儀器廠;ELx800 酶標(biāo)儀:BioTek 公司;CO2恒溫培養(yǎng)箱:日本SANYO 公司;超凈工作臺(tái):蘇州凈化設(shè)備廠;可調(diào)式移液器子天平:Sartious 公司;RPM-I 1640 培養(yǎng)液、胰酶:Gibco 公司;四甲基偶氮唑藍(lán):MTT，Sigma 公司;超級(jí)新生牛血清:杭州四季青生物科技有限公司;二甲基亞砜(DMSO):天津市化學(xué)試劑二廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 山蒼子揮發(fā)油提取方法

取陰干保存的山蒼子503.6 g，在萃取釜溫度為45 ℃，壓力為30 MP，分離柱1 溫度為30 ℃，壓力為7.5 MP，分離柱2 溫度為25 ℃，壓力為4.5 MP，二氧化碳流速為20 kg/h 的條件下超臨界1 h，制取芳香油26.5 g，用過濾膜過濾后裝樣品瓶測(cè)試其成分。

1.3.2 山蒼子揮發(fā)油GC-MS 分析方法

色譜柱為HP-5MS 毛細(xì)管柱，固定相為(5%-苯基)-甲基聚硅氧烷，載氣為氦氣，EI 230 ℃四極桿150 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，分流比50∶1，柱初溫50℃，保持2 min，3 ℃/min 升溫到100 ℃，5 ℃/min 升溫到240 ℃保持14 min。通過面積歸一化法對(duì)鑒定出的化合物進(jìn)行半定量，檢索數(shù)據(jù)庫為NIST 08。

1.3.3 山蒼子揮發(fā)油對(duì)腫瘤活性測(cè)定方法

揮發(fā)油對(duì)四種癌細(xì)胞的抑制率(IR)及半抑制濃度(IC50值)測(cè)定采用MTT 比色法［4］。人肺腺癌細(xì)胞(SPCA-1)、人肝癌細(xì)胞(BEL-7402)、人胃癌細(xì)胞(GSC-7901)和人白血病細(xì)胞(K562)分別以2 ×104個(gè)/mL、7 ×104個(gè)/mL、4 ×104個(gè)/mL 和1 ×104個(gè)/mL 接種于96 孔板中。每孔體積180 μL，在CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)8～12 h，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度藥液(板內(nèi)終質(zhì)量濃度為1、10、100 μg/mL)取山蒼子油20 μL。加藥細(xì)胞培養(yǎng)44 h 后，每孔加入MTT 溶液(1 mg/mL)50 μL，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h，取出傾去上清液，每孔加入150 μL DMSO，振蕩10 min 后，使用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀于570 nm 測(cè)定各孔光吸收值。同時(shí)設(shè)置空白組(僅加入不含細(xì)胞的培養(yǎng)液)和對(duì)照組(以培養(yǎng)液替代藥物)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。初篩時(shí)以最大濃度檢測(cè)其抑制率，以抑制率大于50%為有效。抑制率(%)={［A(對(duì)照)-A(給藥組)］/A(對(duì)照)}×100。由初篩所得數(shù)據(jù)，選取有活性的樣品，經(jīng)稀釋后，進(jìn)一步測(cè)定其抑制率，得到半數(shù)抑制濃度IC50，即以同一樣品濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以抑制率為縱坐標(biāo)，作回歸曲線，計(jì)算IC50。

抗腫瘤藥物療效的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)之一，合成化合物或植物提取物純品的半數(shù)抑制濃度IC50＜10 μM，或植物粗提物的IC50＜20 μg/mL，并有細(xì)胞毒性的劑量依賴關(guān)系，且最高抑制效率應(yīng)達(dá)80%以上，則判定樣品在體外對(duì)細(xì)胞有殺傷作用。

2 結(jié)果與分析

2.1 山蒼子成分解析［5］

在山蒼子油中已鑒定出的52 種化合物，占揮發(fā)油總量的95.65%，主要成分為6-甲基-5-庚烯-2-酮、D-苧烯、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、a-檸檬醛、β-檸檬醛，其中檸檬醛的總含量為60.22%。

表1 海南山蒼子揮發(fā)油化學(xué)成分Table 1 Chemical components of the essential oil of Hainan L.cubeba

2.2 山蒼子揮發(fā)油抗腫瘤活性分析

采用分子蒸餾技術(shù)分離山蒼子芳香油，包括:一次分餾:蒸餾溫度45 ℃、冷卻水-5 ℃、壓力2 mbar，轉(zhuǎn)數(shù)395 rpm、加料速度145 滴/min，接樣輕組份(D1)，重組份(R1);二次分流:蒸餾溫度60 ℃，冷卻水-5 ℃，壓力1 mbar，轉(zhuǎn)速395 rpm，加料速度120滴/min，接樣檸檬醛(D2)，重組份(R2)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示山蒼子揮發(fā)油及各組分對(duì)癌細(xì)胞均顯示出一定抑制作用，抗腫瘤半抑制濃度值見表2。數(shù)據(jù)顯示山蒼子揮發(fā)油對(duì)GSC-1 抑制活性比較好，IC50為6.29 μg/mL;組份D1 對(duì)K562 抑制活性比較好，IC50為16.6 μg/mL;組份R1 對(duì)K562、BEL-7402 的抑制活性比較好，IC50分別為7.76 μg/mL、16.8 μg/mL;組份D2 對(duì)K562、BEL-7402 的抑制活性比較好，IC50分別為6.73 μg/mL、14.34 μg/mL;組份R2 對(duì)K562、BEL-7402 的抑制活性比較好，IC50分別為5.97 μg/mL、19.18 μg/mL。

表2 抗腫瘤半抑制濃度值Table 2 IC50values of essential oil of Hainan L.cubeba against different cancer cells

3 結(jié)論

海南山蒼子油主要成分為6-甲基-5-庚烯-2-酮、D-苧烯、3，7-二甲基-1，6-辛二烯-3-醇、a-檸檬醛、β-檸檬醛，其中檸檬醛的總含量為60.22%。鑒定出的52 種化合物，占揮發(fā)油總量的95.65%。活性測(cè)試結(jié)果顯示海南山蒼子揮發(fā)油對(duì)人肺腺癌細(xì)胞、人肝癌細(xì)胞、人胃癌細(xì)胞和人白血病細(xì)胞有一定抑制效果，其中對(duì)人胃癌細(xì)胞的抑制活性最好，IC50為6.29 μg/mL。組分D1、R1、D2、R2 對(duì)白血病細(xì)胞的抑制活性最好，IC50分別為16.6、7.76、6.73、5.97 μg/mL。

海南山蒼子揮發(fā)油及分離的各組份都顯示出很好的抗腫瘤活性，組份D1、R2 是分離檸檬醛的副產(chǎn)品，R2 顯示出最好的抗人白血病細(xì)胞活性，可以進(jìn)一步研究開發(fā)，提高海南山蒼子油的利用價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)效益。

海南山蒼子揮發(fā)油的生物活性活性是多方面的，在藥用上有很大的用途。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)海南山蒼子油有效成分的分析評(píng)價(jià)及各組份的活性測(cè)試，為山蒼子資源在創(chuàng)新中成藥、天然香料及綜合利用等方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 Zhao MQ(趙銘欽)，Shu CT(蘇長濤)，Ji XM(姬小明)，et al.Research advance of integrated utilization of Litsea cubeba oil.J Anhui Agric Sci (安徽農(nóng)業(yè)科學(xué))，2007，35:7866-7868.

2 Yu BL(余伯良)，Luo HB(羅惠波)，Zhou J(周健)，et al.Study on the active ingredient of antibiotic activities of Litsea cubeba oil on moulds and the effect on aflatoxin production.J Sichuan Instit Light Ind Chem Technol (四川輕化工學(xué)院學(xué)報(bào))，2002，15:32-36.

3 Wang ZN(王祝年)，Xiao BS(肖邦森)，Li YL(李淵林)，et al.Cataloguing of spice plants in Hainan island.Chin J Trop Crops(熱帶作物學(xué)報(bào))，2002，(23)4:62-72.

4 Mosmann T.Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods，1983，65(1-2):55-63.

5 Zhou X(周欣)，Mo BB(莫彬彬).The study on chemical components of volatile oil which from Litsea cubeba (Lour.)Pers.growing in Guizhou.J Guizhou Univ(貴州大學(xué)學(xué)報(bào))，2001，18:45-47.