天然牛磺酸對肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1 表達的調控

文 彬，陳 然，彭佩純，鄧 鑫

廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院，南寧 530011

肝硬化的形成是一個多因素、多環節、多途徑的病理損傷過程。MMP-9 是基質金屬蛋白酶(MMPs)家族類重要成員，可以水解沉積的細胞外基質(ECM)。整合素作為跨膜信號分子，介導細胞與細胞外基質黏附，通過激活多種信號分子，導致細胞生物學行為改變［1］。越來越多證據表明細胞外基質的合成、降解功能失衡［2］及整合素介導的細胞外基質-整合素-細胞骨架黏附網絡系統可以調控肝星狀細胞的增殖與凋亡，在肝纖維化形成中發揮重要作用［3］。天然牛磺酸是名貴中藥“牛黃”的有效成分之一，前期的實驗研究發現天然牛磺酸具有較好的抗肝纖維化作用［4］。本研究通過熒光定量PCR、免疫蛋白印跡法探討天然牛磺酸對肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1 表達的影響，旨在為進一步揭示天然牛磺酸抗肝硬化的作用機制提供依據。

1 材料與儀器

1.1 實驗動物

SD 大鼠，SPF 級，6～7 周齡，雄性，體重(170 ±20)g，廣西醫科大學動物實驗中心提供，動物合格證:scxk 桂2009-0002。

1.2 主要試劑及儀器

天然牛磺酸從烏蛤肉提取，采用熱水提取法［5］，紅外光譜儀鑒定產品質量;四氯化碳(CCl4)，分析純，購于天津富宇精細化工試劑廠產品;食用酒為北京方莊酒廠提供;食用橄欖油(西班牙貝蒂斯);肝纖四項放射免疫分析測定盒(上海海軍醫學研究所生物技術中心產品);總RNA 提取試劑盒(K0731)、逆轉錄試劑盒(K1622)、熒光擴增試劑盒(k0222)均由(加拿大Fermentas 公司)提供;鼠抗單克隆Integrin β1 抗體(英國Abcam 公司，貨號:ab52971)、鼠抗單克隆MMP9 抗體(英國Abcam 公司，貨號:ab76003);HRP 標記的二抗(美國Bio-rad公司，批號:172-1011);PVDF 膜(美國Millipore 公司，批號:IPVH00010);超微量分光光度計(美國Qμawell，Q5000);熒光定量PCR 儀(美國ABI 公司，ABI Stepone Plus)。

2 實驗方法

2.1 模型制備

采用復合因素法［6］制備肝硬化大鼠模型，大鼠首次以0.5 mL/100 g 皮下注射(橄欖油60% +40%CCl4)混合液，以后每隔3 日按0.3 mL/100 g 體重皮下注射，每周2 次;15%酒精為唯一飲料，0.5%膽固醇、20%豬油、79.5%玉米面的高脂飼料喂養，滿10 周時隨機抽取5 只大鼠行肝臟病理學檢測;正常組則以普通飼料和純凈水喂養。

2.2 動物分組

75 只SD 大鼠適應性飼養1 周后，隨機分為對照組、模型組、天然牛磺酸高、中、低劑量組，每組各15 只。正常對照組不經造模處理，從實驗第1 d 開始，給予相同劑量的生理鹽水皮下注射;模型組給藥方法同模型制備;天然牛磺酸治療組在造模成功后，按高中低(1.2、0.6、0.3g/kg·d)劑量灌胃，每天一次，連續60 d，直至實驗結束;模型組及對照組大鼠給與相同劑量生理鹽水灌胃。

2.3 血清肝纖維四項指標測定

血清HA、LN、IV、PCIII 的檢測采用放射免疫法，嚴格按試劑盒步驟操作。

2.4 實時熒光定量PCR 檢測MMP-9、Integrin-β1 mRNA 的表達

各基因引物序列如下:MMP-9 上游:AAGGTCGCTCGGATGGTTAT，下游:AGTTGCCCCCAGTTACAGTG;Integrin-β1 上 游:TTGCCTTGCTGCTGATTTGG，下游:AGTTGTCACGGCACTCTTGT;GAPDH 上 游:TGACTCTACCCACGGCAAGT，下 游:TACTCAGCACCAGCATCACC。取新鮮肝臟組織，應用TRlzol 法抽提總RNA，超微量分光光度計測定OD260/280 吸光值，計算總RNA 含量及純度。嚴格按照逆轉錄試劑盒(K1622)將RNA 逆轉錄成cDNA后進行擴增反應。以GAPDH 為內參基因，QPCR 體系配置(20 μL):2 ×Master Mix 10 μL，Forward Primer(10 mM)0.8 μL，Reverse Primer(10 mM)0.8 μL，cDNA 0.8 μL，Water nuclease-free 7.6 μL。QPCR 反應條件:Integrin-β1 反應條件:95 ℃預變性5 min;95℃15s 變性，62 ℃1 min 退火，擴增35個循環;最后72 ℃延伸7 min。MMP-9 反應條件:94 ℃預變性4 min 后，以94 ℃變性40 s，60 ℃退火35 s，共40個循環，最后72 ℃延伸10 min。PCR 反應結果數據采用2-△△CT進行相對定量比較。

2.5 免疫蛋白印跡檢測MMP-9、Integrin-β1 蛋白的表達

采用免疫蛋白印跡技術，取100 mg 新鮮肝組織加裂解液(50 mmoL/L Tris-HCL pH 7.2，0.15mol/L NaCl，1%NP-40，1%SDS，5 mmoL/L EDTA，1 mmoL/L PMSF)充分裂解，4 ℃，12000 rpm 離心10 min，取上清提取肝組織總蛋白，測定總蛋白濃度。取40 μg 總蛋白，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉移至PVDF 膜上，經5%脫脂奶粉溶液封閉后，分別加入一抗MMP-9(1∶100)、integrin-β1(1∶500)，抗體4 ℃孵育過夜，洗滌后以偶聯HRP 標記的二抗(1∶5000)結合反應，ECL 顯影曝光，GAPDH 為內參，Quantity One 軟件半定量分析特異性條帶灰度值，與內參灰度值的比值為蛋白相對含量。

2.6 統計學方法

應用SPSS 17.0 統計軟件進行分析，計量數據用均數±標準差()表示，多組間指標的檢測采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 大鼠一般情況

正常對照組大鼠一般情況好，皮毛色澤光滑、柔順;模型組大鼠精神萎靡，易驚恐煩躁，體重減輕，皮毛色澤無光滑，造模期間死亡4 只，隨機抽取的5 只大鼠肝臟病理學檢測均提示肝硬化模型制作成功;天然牛磺酸治療組大鼠皮毛柔順，體重增加，精神狀況明顯改善，治療期間無死亡。

3.2 天然牛磺酸對大鼠血清肝纖四項的影響

與對照組相比，模型組大鼠血清HA、LN、IV-C和PCIII 水平顯著升高(P＜0.05);與模型組相比，天然牛磺酸各劑量組HA、LN、IV-C 和PCIII 均明顯降低(P＜0.01);中、高劑量組降低HA、LN、IV-C和PCIII 水平明顯優于低劑量組(P＜0.05)，中、高劑量組間比較差異無統計學意義(P ＞0.05)(見表1)。

表1 各組大鼠血清肝纖維化指標比較()Table 1 Indices of serum liver fibrosis in rats()

表1 各組大鼠血清肝纖維化指標比較()Table 1 Indices of serum liver fibrosis in rats()

注:NT 代表天然牛磺酸，與對照組比較，△P＜0.01;與模型組比較，★P＜0.01;與中劑量組比較，○P ＞0.05。Note:NT-Natural Taurine，Compare with control，△P＜0.01;Compare with Model，★P＜0.01;Compare with NT-M，○P ＞0.05.

圖1 GAPDH、MMP-9、Integrin-β1 擴增和溶解曲線圖Fig.1 Amplification and meltcurves of GAPDH，MMP-9，Integrinβ1

3.3 RNA 純度及PCR 擴增曲線

提取總RNA 用超微量分光光度計測定OD260/280 吸光值在1.8～2.0 之間，RNA 純度符合擴增要求。GAPDH、MMP-9、Integrin-β1 實時熒光定量PCR擴增曲線呈S 型，基線平滑，將檢測臨界點定在CT值，即PCR 產物進入指數增長期的起始點。產物熔解曲線呈銳利的單一峰，熔解溫度(Tm)均一，說明PCR 產物特異性高，無雜帶(見圖1)。

3.4 天然牛磺酸對大鼠肝組織MMP-9、Integrinβ1 mRNA 的表達水平影響

以相對定量法2-△△CT值［7］比較各組大鼠MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表達水平，發現模型組MMP-9、Integrinβ1 mRNA 表達水平明顯高于正常對照組;天然牛磺酸低劑量組MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表達降低，與模型組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，天然牛磺酸中高劑量組MMP-9、Integrin-β1 mRNA表達降低尤明顯，與模型組比較差異非常顯著(P＜0.01)。(見圖2)。

圖2 各組大鼠肝組織MMP-9、Integrin-β1 mRNA 表達水平比較Fig.2 MMP-9，Integrin-β1 mRNA expression level in different groups

3.5 天然牛磺酸對肝硬化大鼠MMP-9、Integrin-β1蛋白表達的調控

各組大鼠肝組織MMP-9、Integrin-β1 與內參GAPDH 平均灰度值比值分別為:正常組(4.1 ±1.0，2.2 ±0.6)，模型組(9.0 ±1.9，5.0 ±1.1)，高劑量組(4.4 ±1.1，2.4 ±0.7)，中劑量組(4.3 ±1.1，2.4±0.8)，低劑量組(6.1 ±1.3，3.6 ±0.9)。與正常組相比，模型組大鼠肝組織MMP-9、Integrin-β1 蛋白表達明顯增加(P＜0.01);天然牛磺酸各劑量組可以顯著降低模型組MMP-9、Integrin-β1 蛋白表達，差異均有統計學意義(P＜0.01);中劑量組降低MMP-9、Integrin-β1 蛋白表達明顯優于低劑量組(P＜0.01)，與高劑量比較差異無統計學意義(P ＞0.05)(見圖3)。

圖3 各組大鼠MMP-9 蛋白(A)、Integrin-β1 蛋白(B)表達水平Fig.3 MMP-9(A)andIntegrin-β1(B)protein expression levels in different groups of rats

4 討論

肝硬化目前尚缺乏良好的治療手段，中醫中藥在此方面具有廣闊前景，天然牛磺酸是名貴中藥“牛黃”的有效成分之一，也是多種中藥的有效成分，海洋生物如烏蛤、珍珠母、牡蠣、海藻等含有豐富的天然牛磺酸，現代藥理學研究表明［8，9］:天然牛磺酸具有解毒護肝，抗氧化損傷，抗腫瘤及增強機體免疫功能等活性。我們的前期研究也證實天然牛磺酸可以通過減輕肝細胞炎癥反應，降低脂質過氧化而達到抗纖維化的作用［4］。

隨著對肝纖維化機制了解的深入，細胞外基質-整合素-細胞骨架調控系統在肝纖維化中的作用越來越受到重視。整合素作為一類黏附分子，主要由α 和β 兩條肽鏈以非共價鍵連接而形成的異二聚體的跨膜糖蛋白，其配體主要為細胞外基質(ECM)蛋白［10］。目前認為肝星狀細胞的激活、凋亡等與細胞外基質、黏附分子的相互作用密切相關［11］。也有報道ECM-整合素-細胞骨架組成的黏著斑已成為肝纖維化進展的關鍵環節，ECM 可以與整合素通過FAK信號傳導來調控肝星狀細胞(HSC)的活化增殖與凋亡，進而影響肝纖維化的進程［3］。

基膜性MMPs 主要包括MMP-2 和MMP-9，是調控肝內細胞外基質(ECM)降解的主要酶類，其在肝纖維化中的作用，目前仍存在不同觀點，有認為MMP-9 可以破壞肝竇內基底膜，破壞肝細胞內環境，致使肝星狀細胞(HSC)活化，促進肝纖維化的形成［12］。也有研究表明增加MMP-9 表達量不僅可以降解過多沉積的間質性膠原纖維，而且抑制HSC 膠原酶表達及減少基質金屬蛋白酶抑制因子的產生，對逆轉肝纖維化發揮有利作用［13，14］。本實驗結果發現模型組大鼠MMP-9 表達量明顯增多，至于在肝纖維化進程中起促進或逆轉作用，目前機制尚未明確:一方面肝纖維化形成中由于膠原過度沉積，MMP-9 持續升高可能是機體代償性降解過度沉積的細胞外基質;另一方面MMP-9 持續增多，是否破壞內基底膜及促進HSC 激活，此方面的論據仍有待進一步考證。

Sheu 等研究表明MMP-9、Integrin-β1 存在多種生物體內，并且可以表達于多種正常細胞［15］。本實驗中各組大鼠肝內均可見到MMP-9、Integrin-β1 表達，與Sheu 等研究結果一致。但肝硬化大鼠MMP-9、integrin-β1 表達較正常大鼠異常增多，說明MMP-9、Integrin-β1 與肝纖維化密切相關，其在基因和蛋白的高表達與肝硬化呈正相關，兩者之間可能通過(細胞外基質-整合素-細胞骨架)的黏附而發揮協同作用。天然牛磺酸可以顯著降低MMP-9、Integrinβ1mRNA 及蛋白表達，以中、高劑量組較明顯，可見天然牛磺酸抗肝硬化的作用機制可能與調控MMP-9、Integrin-β1 表達水平有關，但天然牛磺酸對MMP-9、Integrin-β1 調控機制及信號傳導途徑仍未明了，有待進一步深入研究。

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